IMSTAR : l’imagerie à haut contenu

L’innovation pharmaceutique n’est pas qu’une affaire de chimie, de criblage à haut débit et de modèles structuraux. Les techniques actuelles d’imagerie cellulaire et moléculaire apportent un éclairage primordial pour détecter des indices d’activité ou de toxicité in cellulo. IMSTAR, une société parisienne, s’est positionnée sur ce secteur en pleine expansion.

Depuis sa création en 1985 à Paris par Françoise Soussaline comme « spin-off » du département de biologie du Commissariat à l’énergie atomique (CEA), IMSTAR s’est imposée comme un bâtisseur de ponts entre recherche fondamentale et applications industrielles dans le domaine de l’imagerie cellulaire multidimensionnelle. Son originalité : être l’une des sociétés spécialistes de l’« imagerie à haut contenu » sur cellules vivantes ou fixées, précise Jérôme Sallette, responsable du marketing scientifique. « Nos systèmes d’imagerie PathfinderTM rendent possible la détection automatisée des cellules individuelles et d’objets subcellulaires, explique-t-il. En drug discovery, cette technologie permet de comprendre l’activité de molécules sur des cibles intracellulaires et de mesurer une éventuelle toxicité, en la qualifiant. On passe donc, avec cette technologie, du criblage primaire à haut débit de molécules, rapide mais pauvre en informations spécifiques, à un criblage plus lent mais à haut contenu informatif qui permet, par exemple, de quantifier  avec précision les multiples paramètres caractérisant les interactions  moléculaires et cellulaires. »


 Microscopie en fluorescence et intelligence logicielle

Les progrès techniques des dernières années ont été fulgurants dans le domaine des molécules fluorescentes, grâce auxquelles on visualise par vidéo-microscopie ou microscopie confocale les organites de cellules vivantes et toutes sortes de phénomènes intracellulaires (mouvement du cytosquelette, trafic des protéines, expression de gènes, etc.). L’intelligence des logiciels et la modélisation mathématique n’ont pas été en reste, et rendent possible par exemple l’analyse automatique du contour et de la morphologie des cellules et des organites (mitochondries, réticulum...) et le diagnostic d’états cellulaires anormaux provoqués par une molécule. L’ensemble permet de disposer d’instruments inédits et extrêmement performants pour la détection automatisée des stress toxiques.
IMSTAR propose une gamme de produits construits sur la technologie Pathfinder qui permet de construire une architecture modulaire, évolutive en fonction des besoins de chaque client, et ainsi de lui proposer la solution adaptée à ses problèmatiques. La société cible trois marchés complémentaires : la toxicologie génétique pour la gestion des risques environnementaux, les tests de composés chimiques ou le monitoring de personnes exposées à des polluants, terrains qu’elle occupe déjà ; en second lieu, la drug discovery à haut contenu, marché émergent ; et, enfin, l’anatomopathologie et la recherche clinique, un marché en pleine mutation. Sur ce dernier segment de marché, « les outils diagnostics in vitro aident d’ores et déjà, en quantifiant des biomarqueurs dans des échantillons de patients, à mesurer l’évolution de la maladie ou de la guérison, indique Jérôme Sallette. Ils peuvent apporter une aide à la décision en contribuant à identifier les personnes qui répondent le mieux à un traitement. » C’est ainsi qu’IMSTAR a développé CerviK, une plate-forme d’analyse à haut débit d’échantillons de col utérin pour l’identification de lésions cancéreuses.</><//>

 
Dispositif de biopuces cellulaires à nanogouttes associé au système Pathfinder d’Imstar.

A gauche, une pipette piézoélectrique dépose mille nanogouttes sur une lame de verre. Chaque nanogoutte contient au bout de quelques jours de culture plusieurs dizaines de cellules hépatiques humaines rendues sensibles aux facteurs de stress. Le système Pathfinder permet de collecter des informations précises sur chacune des cellules, sur sa morphologie et les modifications moléculaires qui s’y déroulent, traduites par la production de molécules fluorescentes. On peut ainsi obtenir mille mesures indépendantes du stress cellulaire provoqué par des substances toxiques à différentes concentrations, ici l'arséniate de sodium, un dérivé de l'arsenic.
Source : F. Lemaire et al. (2007) Toxicity Assays in Nanodrops Combining Bioassay and Morphometric Endpoints, PLoS ONE 2(1): e163. doi:10.1371/journal.pone.0000163


 Un criblage par nanogouttes

IMSTAR a également développé, avec plusieurs partenaires réunis dans le programme européen Toxdrop du sixième PCRD (voir l’encadré), une méthode de criblage à large échelle et à haut contenu pour la détermination des risques toxiques à faibles doses. Des chercheurs du CEA de Grenoble (équipe de Béatrice Schaack) et d’IMSTAR, associés à ce programme, ont démontré que l’utilisation combinée du système Pathfinder, de cellules hépatiques rendues sensibles aux facteurs de stress, et de biopuces constituées de mille nanogouttes de culture d’environ 100 nanolitres, est efficace pour détecter les signatures toxiques spécifiques de plusieurs substances à différentes doses (voir l’image ci-dessus). Ce nouveau test toxicologique miniaturisé et à haut débit, pourrait trouver sa place pour l’évaluation des produits chimiques prévue par le règlement européen REACH.

« Cependant, ce type de technique nanométrique est universalisable et pourrait intéresser à plus long terme l’industrie pharmaceutique, note Jérôme Sallette. Il est toutefois peu probable qu’il s’y étende prochainement car celle-ci a déjà investi dans l’acquisition de technologies à microplaques 96 puits ou dans des partenariats lui assurant cette expertise. »

Néanmoins, la miniaturisation permet de n’utiliser qu’une très faible quantité de la substance, ce qui peut être un argument pour tester des candidats médicaments dont le coût de production est généralement élevé.
IMSTAR, qui compte douze salariés et a trouvé la rentabilité grâce aux revenus de ses produits et services, se trouve associée à un réseau de travail très dynamique et à plusieurs projets européens axés sur l’évaluation des liens entre environnement, nutrition et santé : outre Toxdrop, Comics, un second projet de développement de tests alternatifs à l’expérimentation animale fondé sur le perfectionnement et l’automatisation à large échelle de tests de génotoxicité (test comète) et les puces à cellules, enfin, NewGeneris, qui vise à étudier les conséquences du régime alimentaire  sur la santé du fœtus (1, 2). En Ile-de-France, IMSTAR pilote en outre le programme Biotype labellisé par le pôle de compétitivité Medicen Paris Région, destiné à identifier, dans le modèle du cancer de la prostate, des profils répondeurs aux médicaments en vue de développer des thérapeutiques personnalisées. Malgré la concurrence de grosses firmes telles que Cellomics (Fisher Biosciences), Becton Dickinson, General Electric Healthcare pour  l’analyse cellulaire ou de Metasystems pour l’analyse d’image en cytogénétique, la société parisienne voit l’avenir avec optimisme.


(1) http://comics.vitamib.com/project
(2) www.newgeneris.org

Pour en savoir plus
www.imstarsa.com

 L’Europe prend l’initiative sur les médicaments innovants

Rendre les médicaments plus sûrs et efficaces.
L’industrie pharmaceutique européenne et la Commission européenne se mobilisent face à la perte de vitesse de l’Europe dans la compétition mondiale sur l’innovation thérapeutique. Les enjeux sont médicaux mais aussi économiques et politiques.

Face à l'emprise des Etats-Unis sur le marché mondial du médicament et la concurrence en hausse des pays asiatiques et d'Amérique du Sud, l'Europe veut accroître sa compétitivité dans l'innovation pharmaceutique. Un partenariat public-privé (PPP), l'Initiative médicaments innovants (Innovative Medicine Initiative, IMI), a été lancé en mai 2007 par la Commission européenne et la Fédération européenne des associations et industries pharmaceutiques (EFPIA). Après Artemis, consacrée aux  systèmes informatiques embarqués, il s'agit de la deuxième « Initiative technologique conjointe » (JTI) de l'UE, destinée à « encourager les investissements européens dans le domaine de la recherche, permettre d’atteindre des masses critiques en unifiant des projets actuellement fragmentés et assurer une gestion rigoureuse et efficace des programmes ». L’IMI devra à ce titre être adoptée par le Conseil « compétitivité » des ministres de l'Union européenne d'ici la fin 2007 afin d’émettre ses premiers appels à propositions début 2008.

 
Nouvelles molécules (NME, New molecular entities) produites par les entreprises pharmaceutiques. La perte d’influence des firmes européennes se fait sentir depuis le début des années 2000.
Source : EFPIA

L'objectif global de l'IMI est de « soutenir le développement de nouvelles connaissances, de nouveaux outils et méthodes afin de distribuer plus rapidement sur le marché des  médicaments plus appropriés et plus sûrs ». L'initiative disposera de deux milliards d'euros sur sept ans, fournis à parts égales par la Communauté européenne via le septième programme cadre (2007-2013) et par l'industrie, et répartis vers les petites et moyennes entreprises innovantes (PME) et les universités. Les financements annuels de la Commission devraient être d’une centaine de millions d’euros au départ et augmenter graduellement.
L'IMI tire son origine du constat alarmiste dressé par l’EFPIA dans le cadre de la plate-forme technologique européenne sur les médicaments innovants (European Technology Platform on Innovative Medicines), financée par le sixième programme cadre (FP6) : manque de prédictabilité de la toxicité des médicaments, difficultés à prédire leur efficacité, gestion imparfaite des connaissances (Knowledge Management), béances dans l'éducation et la formation. En collaboration avec des hôpitaux, des universités, des associations de patients et la Commission européenne, l’EFPIA a émis diverses recommandations susceptibles de résoudre ces insuffisances sous forme d’un « agenda stratégique » (1).
Dans le domaine de l'évaluation de la sécurité des médicaments, l'agenda présente neuf propositions parmi lesquelles la création d'un « centre européen de recherche sur la sûreté des médicaments », l'établissement d'un réseau destiné à développer les biomarqueurs de toxicité, et la mise au point de méthodes in silico de prédiction de types de toxicité connus ou nouvellement découverts.

 
Modèle d’interaction entre un inhibiteur et sa cible protéique
© Sanofi-Aventis

La prédiction de l'efficacité des molécules fait l'objet de cinq recommandations liées aux cinq types de pathologies identifiés comme prioritaires en Europe (maladies du cerveau, cancers, maladies infectieuses, pathologies du métabolisme, maladies inflammatoires) : création de réseaux européens d'imagerie spécialisés, centres régionaux d'excellence, centres européens de validation de nouveaux biomarqueurs, accroissement des collaborations avec les patients et les agences réglementaires nationales et européenne (EMEA). Ces deux domaines de prédilection devraient être soutenues, poursuit l’agenda, par une structure de « gestion des connaissances translationnelles » appuyée sur une plate-forme technologique apte à intégrer et analyser les données. L'éducation et la formation, enfin, pourraient être améliorées par la création d'une académie européenne de recherche médicale et l'institution de programmes multidisciplinaires capables d’entraîner les professionnels à intégrer la biologie dans leur pratique.L’objectif de l’IMI est en fait éminemment stratégique et politique. Le document préparé en guise d’avertissement, fin février 2007, par les vingt-quatre firmes pharmaceutiques de l’EFPIA (2) à destination de la Commission européenne est transparent  : « Etant donné que l'industrie biopharmaceutique a reconnu la nécessité d'investir davantage dans la recherche pharmaceutique précompétitive (3), si l'IMI n'est pas installée en Europe, l'industrie biopharmaceutique participera aux initiatives non européennes pour satisfaire son besoin d'innover. Cela ne signifie pas que l'établissement d'une initiative technologique conjointe (JTI) gardera l’industrie d'investir hors d'Europe, puisque les conditions de marché très attractives des Etats-Unis auront toujours une influence positive sur les décisions d'investissements. Cela veut plutôt dire qu'aussi longtemps que l'Europe sera un marché avec un accès et des prix très contrôlés, l'initiative technologique IMI sera une occasion d’accroître l'attractivité de l'Europe et de construire une capacité d’expertise dans la recherche pharmaceutique précompétitive. » (4)


(1) Agenda stratégique du programme de recherche de l’initiative Médicaments Innovants
www.imi-europe.org/Publications.aspx?viewCategory=Researchx20Agenda
(2) AstraZeneca, Bayer-Schering Pharma, Boehringer Ingelheim, Chiesi, Eli Lilly, Esteve,
Genzyme, GSK, Johnson & Johnson, Lundbeck, Merck, MSD, Novartis, Novo-Nordisk, Organon, Pierre Fabre, Pfizer, Roche, Sanofi-Aventis, Serono, Servier, Solvay, UCB and Wyeth.
(3) Recherche précompétitive : phase de la recherche et du développement durant laquelle les résultats ne sont pas immédiatement commercialisables.
(3) The Innovative Medicines Initiative, Keys for Success – Industry Input, mars 2007
www.imi-europe.org/DocStorage/PublicSiteAdmin/Publications/20070309_IMI_Keys_for_Success%20Final.pdf

Pour en savoir plus

• IMI (Commission européenne)
  http://ec.europa.eu/research/health/imi/index_en.html
• IMI (EFPIA)
  www.imi-europe.org/ 
• European Technology Platform for Innovative Medicines (Cordis)
  http://cordis.europa.eu/lifescihealth/innovativemedicines.htm  
• European Federation of Pharmaceutical Industries and Association –
  www.efpia.org

 Toxicologie prédictive : une vigie cellulaire à Villejuif

Les tests cellulaires in vitro qui permettent de détecter les dommages 
provoqués par les substances chimiques de l’environnement et leurs 
risques pour la santé humaine peuvent être adaptés avantageusement 
à l’évaluation des molécules pharmaceutiques. C’est ce que démontre l’expérience d’une entreprise francilienne, VigiCell.

Beaucoup de sociétés de biotechnologie trouvent dans leur berceau une technologie dite propriétaire et quelques brevets qui leur permettent de convaincre des investisseurs de financer leurs premiers pas. Pas toutes cependant. En juin 1999, une chercheuse du CNRS, Yolène Thomas, et un « business angel », Isaac Béhar, font le choix plus osé de lancer une société spécialiste du risque toxicologique sur la base d’un... concept : faire appel aux stratégies expérimentales qui s’approchent au plus près des conditions cellulaires réelles de la physiologie humaine et permettent de détecter le plus tôt possible des indices de stress et de toxicité ; autrement dit, étudier non pas des modèles animaux mais des cellules humaines en analysant suffisamment de paramètres pour prendre en compte la complexité des régulations biologiques.
Le pari est certes risqué mais la jeune société dispose d’un savoir-faire en biologie cellulaire et de liens avec des équipes académiques. Huit ans plus tard, le choix effectué s’est révélé payant. VigiCell, installée depuis 2004 à Villejuif sur le site de l’Institut André Lwoff, à proximité de l’Hôpital Paul Brousse compte désormais onze salariés et son chiffre d’affaires est en croissance. Après avoir augmenté son capital en devenant SAS avec le soutien du fonds d'amorçage Sucseed, VigiCell s’apprête à agrandir ses locaux et prépare une nouvelle augmentation de capital. Spécialiste de toxicologie prédictive, c’est-à-dire de détection précoce des risques de toxicité des substances chimiques, la société pilote le programme IngeCell sur les cellules souches embryonnaires humaines, labellisé en 2006 par le pôle de compétitivité Medicen Paris Région  (voir l’encadré « IngeCell » ), et participe au réseau européen Toxichip, qui vise à trouver des alternatives à l’expérimentation animale en toxicologie (voir l’encadré « Toxichip »).

 Synergies sud-parisiennes

« Nous bénéficions de l’environnement très dynamique du pôle Paris-Sud qui s’organise actuellement dans la région de Villejuif et Kremlin-Bicêtre autour de deux axes forts : la cancérologie et les cellules souches », explique Jean-Emmanuel Gilbert, président du directoire de la SAS. La banlieue sud de Paris dispose en effet de plusieurs centres hospitalo-universitaires de renom (Paul Brousse, Kremlin-Bicêtre, Institut Gustave Roussy, hôpital Henri Mondor de Créteil), de nombreuses équipes de biologie cellulaire et moléculaire CNRS, Inserm et universitaires (universités Paris-Sud, Paris 12 Val de Marne, Evry Val d’Essonne, ENS de Cachan), parties prenantes du pôle de Recherche et d’Enseignement supérieur « PRES UniverSud Paris », d’un hôtel d'entreprises, d’animaleries et de plateaux techniques (plate-forme ARN d’interférence à haut débit et plate-forme cellules souches embryonnaires humaines). « En biologie cellulaire, il est primordial de trouver des collaborations de proximité car les cellules supportent mal les transports », ajoute Jean-Emmanuel Gilbert.
Les clients de VigiCell sont majoritairement des grands groupes industriels et des institutions et collectivités soucieux d’évaluer l’incidence environnementale de produits d’usage courant ou de leurs rejets. La société est en effet devenue experte dans l’analyse des « stress » cellulaires induits par des échantillons issus de produits finis : aliments, effluents de station d'épuration, produits ménagers, matériaux divers, etc.
En outre, l'industrie pharmaceutique, habituée à évaluer le risque toxicologique de ses candidats médicaments en réalisant des essais précliniques sur l’animal et des essais de phase I chez l’homme, « a pris conscience qu'il fallait changer d'outils afin d’identifier très en amont des signaux qui, ensemble, vont donner une évaluation précoce du risque de toxicité des molécules candidates, relève Jean-Emmanuel Gilbert. Cette démarche multiparamètres peut être comparée aux questionnaires demandés par les assurances : chaque question, indépendamment des autres, n'a pas de signification, alors qu’ensemble elles donnent un faisceau d'informations qui permettent de calculer un risque. »

Plate-forme Pathfinder© (IMSTAR) de cytométrie d’image de VigiCell. Totalement automatisée, elle s’adapte bien à la conduite du test « comète » de génotoxicité (électrophorèse sur microgel de cellules ou de noyaux uniques). Dans ce test, la présence d’une « queue » de comète traduit une toxicité vis-à-vis de l’ADN.© VigiCell

VigiCell tente donc aujourd’hui de convaincre des industriels du médicament de transposer cette démarche prédictive dans leurs processus d’innovation. La société dispose d’une « boîte à outils » constituée de tests et protocoles expérimentaux mis au point en interne ou acquis qu’elle adapte aux besoins et à la problématique de chaque client. Cette toxicologie cellulaire « à façon » est complémentaire des tests réglementaires et a l’intérêt de désigner très rapidement les points clés à améliorer ou sur lesquels le développement d’un médicament risque de buter par la suite, assure Jean-Emmanuel Gilbert.


 Vaincre les barrières

Par exemple, VigiCell a intégré et développé un modèle in vitro de la barrière hémato-encéphalique, le système cellulaire qui protège le tissu cérébral des substances chimiques nocives. Cette barrière est due à ce que les cellules endothéliales qui tapissent la paroi des vaisseaux sanguins cérébraux sont soudées par des « jonctions serrées » (zona occludens) et consolidées par des cellules gliales, les astrocytes. Cette architecture, du même coup, empêche la plupart des molécules thérapeutiques à visée neurologique d’atteindre leur cible. Mis à part les petites molécules lipophiles qui diffusent passivement à travers les cellules endothéliales, seul est possible un transfert sélectif de molécules comme le glucose et les acides aminés – les carburants du cerveau, qui s’accomplit grâce à des transporteurs actifs spécifiques. Pour traverser, les molécules hydrophiles doivent emprunter l’un de ces transporteurs ; c’est le cas de la L-dopa, le traitement classique de la maladie de Parkinson.
Dans un contexte de santé publique où les maladies neurologiques et neurodégénératives gagnent en fréquence, la mise au point de modèles in vitro de la barrière hémato-encéphalique est d’une grande utilité, et la concurrence entre laboratoires est forte. Ces modèles permettent aussi bien de tester le pouvoir de traversée d’une molécule que ses effets sur les cellules de la barrière elle-même et donc sur sa perméabilité. VigiCell se targue d’avoir su développer un modèle in vitro qui intègre des transporteurs spécifiques polarisés, en accord avec la réalité physiologique, comme en témoigne la très bonne corrélation des données in vitro et in vivo.

Le marché des tests in vitro de toxicologie est en expansion et on y trouve des sociétés comme BIOalternatives en France (Gencay, Vienne) ou CeeTox (Michigan, Etats-Unis). Dans ce concert, VigiCell insiste sur son adaptabilité et son évolutivité.
« Nous consacrons une part très importante de notre budget à la R&D de manière à perfectionner en permanence notre ’’boîte à outils’’ et à la rendre le plus proche possible des besoins des clients », souligne Jean-Emmanuel Gilbert. L’entreprise a ainsi conçu une démarche adaptée à l’optimisation des « hits » et des « leads » pharmaceutiques qui met l’industriel en position de choisir entre diverses études « à façon », qui porteront sur une ou plusieurs facettes biologiques (génotoxicité, réponse inflammatoire, passage transmembranaire, métabolisation, etc.), et des études standards dans lesquelles sont comparés, sur un ou plusieurs modèles cellulaires, les effets de substances grâce à trois niveaux d’analyse successifs : par exemple atteintes de l’ADN mesurées de façon standardisée par les tests « comète » et « micronoyaux » en cytométrie d’image (voir la photo), analyse du cycle cellulaire par cytométrie en flux, et mesure de l’expression de certaines protéines considérées comme des « bioalertes cellulaires ». Ainsi dotée d’un catalogue de tests, VigiCell espère devenir l’un des acteurs européens du développement pharmaceutique de la toxicologie prédictive.


 Des grenouilles sentinelles pour tests in vivo

De nouveaux détecteurs intégrés servent à étudier les effets de molécules pharmaceutiques. La dernière génération de biocapteurs nanoélectroniques ? Non, des têtards de grenouilles ! La société WatchFrog est un des spécialistes mondiaux de ces sentinelles d’un nouveau genre.

Lorsque l'évaluation des risques sanitaires des nouvelles substances chimiques est devenue légalement incontournable, avec le projet de règlement européen Reach (enregistrement, évaluation, autorisation et restrictions relatifs aux substances chimiques), adopté en décembre 2006 et entré en vigueur le 1er juin 2007, l'industrie européenne a commencé à se tourner vers les laboratoires qui disposent d'un savoir-faire reconnu en biotechnologie. Difficile en effet, quand on est spécialisé en production chimique, de gérer en interne des tests biologiques lourds à mettre en œuvre et demandant des compétences particulières.
Parmi ces laboratoires, l’unité mixte Évolution des régulations endocriniennes du Muséum national d'histoire naturelle (UMR CNRS 5166, Département Régulations, Développement et Diversité Moléculaire) s'est fait un nom dans la connaissance de la physiologie comparée des hormones et de l'impact de polluants, appelés perturbateurs endocriniens, sur le système endocrinien et les grandes fonctions physiologiques. Cette équipe a mis au point des modèles transgéniques de xénopes, des grenouilles africaines. Ils permettent de suivre in vivo, chez le têtard, les modifications physiologiques induites au cours de la croissance, lors de la métamorphose ou sous l’effet de facteurs de l’environnement (1, 2). Devant l'intérêt de plusieurs industriels, Barbara Demeneix, directrice de ce laboratoire, et Gregory Lemkine, ingénieur de recherche de l’unité et en charge du transfert technologique au Muséum, décident de créer WatchFrog, littéralement « grenouille sentinelle », en novembre 2005.


 Les atouts de la transparence

« Nous avons vite compris que nos méthodes, au départ axées sur le marché de l’évaluation du risque environnemental, permettaient également de détecter l’activité de molécules pharmaceutiques et cosmétiques », explique Gregory Lemkine, aujourd’hui président de WatchFrog. En effet, depuis la fin des années 1990, l’industrie du médicament s’intéresse à d’autres modèles d’évaluation toxicologique que les rongeurs, comme le poisson zèbre (Danio rerio), le poisson médaka (Oryzias latipes), utilisé couramment au Japon, et les xénopes. En 2002, Aventis Pharma (futur Sanofi-Aventis) a ainsi conclu un partenariat inédit avec Zygogen (Atlanta), une société spécialiste de l’emploi de larves du poisson zèbre pour la découverte de médicaments. Tous ces modèles ont en commun d’offrir des coûts de production et d’utilisation relativement peu élevés, des larves minuscules et transparentes à travers lesquelles on peut visualiser « en direct » et en temps réel les tissus et les modifications d’expression de gènes, et la possibilité d’analyser en parallèle les effets de plusieurs molécules sur plusieurs organes.
Les xénopes (Xenopus laevis et Xenopus tropicalis) constituent cependant les modèles favoris de WatchFrog. Plus évolués que les poissons (plus de 150 millions d’années d’évolution les séparent), les amphibiens possèdent une physiologie très proche de celle des mammifères. Les techniques actuelles permettent d’obtenir plus aisément que chez les poissons des lignées stables de xénopes génétiquement modifiés. Quarante-huit heures après la fécondation et la formation de l’œuf, la jeune larve, qui mesure 2 mm, possède déjà un système nerveux central et périphérique, un squelette (encore cartilagineux), une vraie peau, un système cardiovasculaire et lymphatique complet, un système hormonal, un thymus et un système immunitaire, explique Gregory Lemkine. Elle représente un véritable détecteur intégré dans lequel peuvent être étudiés simultanément différents marqueurs biologiques sensibles à l’activité des molécules à tester. Le procédé est de la sorte beaucoup plus proche de la réalité physiologique que les modèles cellulaires et les puces à ADN ou à protéines, souligne Gregory Lemkine.

 
Larve transgénique de xénope en fluorescence verte
© WatchFrog

 
Larve transgénique de xénope en fluorescence verte
© WatchFrog

La devise de WatchFrog est : « In vivo fiat lux », « que la lumière soit in vivo ». En effet, la première étape du procédé consiste à produire des larves transgéniques comprenant des constructions génétiques qui activent la production d’une protéine lumineuse fluorescente en réponse à l’action physiologique d'une molécule. Au sein du même organisme, plusieurs couleurs de fluorescence permettent de distinguer en même temps un effet principal d’un effet secondaire indésirable. Ce détecteur fluorescent intègre les gènes dont on cherche à vérifier s’ils sont activés sous l’action de l'échantillon à tester. Dès lors, il « s'allume » en couleur dès qu’une régulation biochimique active ces gènes, la fluorescence étant visible grâce à la transparence de la larve, ce qui évite d’avoir à disséquer l’animal.


 Détecteurs à façon

Il est possible de construire à façon autant de têtards transgéniques que de tests souhaités, et ainsi de détecter des effets pharmacologiques variés sur différents marqueurs biologiques dans le système nerveux, le système cardiovasculaire, etc. Pour cela, on immerge les jeunes larves transgéniques dans des microplaques à 96 puits directement au contact de la substance à tester. Au bout de quelques heures, un système de lecture automatisé permet de visualiser la distribution dans l’organisme larvaire de l’activité de la molécule et de la quantifier grâce à la mesure de la fluorescence émise.
Un autre système de lecture mis au point par WatchFrog permet de « lire » les larves dans un flux, ce qui permet de suivre en continu la qualité d’un circuit d’eau ou d’un effluent industriel.

 
Chaque puit d’une microplaque contient une larve dont la mesure de fluorescence révèle par une quantification in vitro l’effet d’un principe actif in vivo.
© WatchFrog

Cette technologie originale a permis à WatchFrog d’être lauréate du sixième concours national d’aide à la création d’entreprises de technologies innovantes en 2004 et de décrocher plusieurs contrats avec des industriels, lui assurant un chiffre d’affaires de quelque 300 k€ en 2006. Outre plusieurs gros clients dans le domaine environnemental, comme EDF et Veolia, la société a pris pied sur le marché du médicament en concluant un contrat de services avec KaroBio, une entreprise biopharmaceutique suédoise spécialisée dans la découverte de médicaments contre les maladies métaboliques (diabète, athérosclérose, etc.). Une expérience qui devrait permettre de valider son approche aux yeux d’autres groupes pharmaceutiques, escompte Gregory Lemkine. Hébergée au Muséum, dotée de sept salariés, WatchFrog envisage de déménager en 2008 pour mieux se développer, l’objectif étant de concevoir et de commercialiser des kits de surveillance et de dosage pour différents secteurs industriels tout en poursuivant une activité de services génératrice d’un flux régulier de revenus.

1. N. Turque et al. (2006) Environ Health Perspect. 113(11):1588-93.
www.ehponline.org/members/2005/7992/7992.pdf
2. V.L. Trudeau et al. (2005) Environ Health Perspect. 113(3):329-34
www.ehponline.org/members/2004/7418/7418.pdf

Pour en savoir plus
www.watchfrog.fr

 BioSystems International : la prédiction par biomarqueurs

Très rares sont en France les sociétés spécialisées dans l’identification de signes biologiques associés aux pathologies. Raison de plus pour s’intéresser à l’une d’elles, BioSystems International. Inspirée par une invention technologique, elle affiche des ambitions certaines en vue du diagnostic précoce de pathologies chroniques et pour prédire les « réponses » de patients aux candidats médicaments lors des essais cliniques.

Afin de prédire l’efficacité potentielle d’un médicament ou de déterminer quelles seront les personnes qui y « répondront » le mieux, l’une des stratégies de prédilection consiste à détecter et caractériser des « biomarqueurs » dans les prélèvements biologiques. L’industrie pharmaceutique en a fait un objectif prioritaire et de nombreuses sociétés de biotechnologies se sont positionnées sur ce marché en croissance. A terme, en effet, l’utilisation de biomarqueurs pertinents pourrait conduire à une réduction de la durée et donc du coût des essais cliniques, tout en améliorant le suivi thérapeutique des patients (voir l’article sur les biomarqueurs).


 Détecter des biomarqueurs à l’état de traces

Défini simplement, un biomarqueur est un indicateur d’un processus biologiques en cours, qui correspond à tout facteur biologique, comme une protéine du sang ou d’un autre tissu, produit en fonction de l’évolution d’une maladie, en réponse à un traitement, à des substances de l’environnement, etc. Ce facteur est facilement détectable lorsqu’il est présent en grande quantité dans le prélèvement – c’est le cas d’une protéine du cerveau que l’on trouve dans le liquide céphalorachidien au cours de la maladie de Creutzfeldt-Jakob, une neurodégénérescence rarissime. Mais il arrive que le biomarqueur se trouve en quantités infimes dans l’échantillon, auquel cas il faut parvenir à le déceler dans le « bruit de fond » formé par les milliers de molécules du fluide biologique ou du tissu. Une fois détecté, il faut en outre l’identifier et valider sa pertinence clinique, c’est-à-dire le fait que son apparition est statistiquement corrélée à une pathologie.
C’est sur la base d’un tel savoir-faire qu’est née la société BioSystems International (BSI), installée dans la Génopole d’Evry (Essonne). BSI a été fondée en mai 2004 par Laszlo Takacs, alors responsable du groupe Génomique et bioinformatique du centre de recherches Pfizer de Fresnes (il est aujourd’hui directeur général et directeur scientifique de BSI), András Guttman, spécialiste des technologies de séparation biologique et aujourd’hui directeur de la technologie (CTO) de la société, ainsi que par Barry Karger et William Hancock, experts en analyse à grande échelle des protéines (protéomique) au Barnett Institute de la Northeastern University (Boston, Massachusetts).
Ces chercheurs ont développé conjointement une technologie de détection de biomarqueurs protéiques, brevetée par la Northeastern University en 2005. BSI bénéficie d’une licence exclusive mondiale d’exploitation de cette technologie pour la découverte de cibles thérapeutiques et de biomarqueurs, pour leur développement et leur commercialisation dans le domaine médical, vétérinaire, agroalimentaire et de la sécurité biologique.
Comparée au couplage électrophorèse bidimensionnelle - spectrométrie de masse, technique classique de séparation et d’identification de protéines dans des échantillons biologiques, qui a tendance à privilégier les molécules abondantes, la méthode de BSI a l’avantage de déceler des protéines à l’état de traces. Reposant sur l’utilisation d’anticorps monoclonaux, comme la méthode ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) utilisée en clinique pour déceler des antigènes, elle peut fonctionner à « haut débit » et est donc beaucoup plus rapide que l’ELISA, tout en étant aussi sensible.
Le principe en est le suivant : à partir d'une fraction d’un prélèvement réalisé chez un patient, tel que le plasma sanguin ou un extrait tissulaire, sur lequel on a pratiqué une méthode d’enrichissement en protéines initialement peu abondantes, on fabrique une « bibliothèque » d’anticorps monoclonaux. On teste alors ces quelques milliers d’anticorps monoclonaux, qui sont donc dirigés contre toutes les protéines immunogéniques (antigènes) du prélèvement, sur une nouvelle fraction de l’échantillon et sur un mélange témoin (criblage). Les différences de liaison anticorps - antigènes entre les deux échantillons peuvent être mises en évidence grâce à une méthode de séparation des protéines. Enfin, une technique de spectrométrie de masse à haut débit est mise en œuvre pour identifier les antigènes auxquels les anticorps se sont liés. Ceux que l’on n’identifie que dans l’échantillon du patient peuvent être considérés comme des biomarqueurs de l’état physiologique correspondant.

 

Cancer du sein en coupe histologique. En rose, travées de tissu conjonctif, en bleu-violet, cellules tumorales
© NCI/Cecil Fox

 Diagnostic et aide à la drug discovery

Grâce à cette plate-forme technologique, BSI mène actuellement des recherches sur les cancers et les autres pathologies chroniques, applicables aussi bien au diagnostic qu’au développement de médicaments.
En cancérologie, l’objectif de BSI est d’améliorer les traitements grâce à un diagnostic précoce. Deux modèles, le cancer du côlon et le cancer du sein, sont étudiés en collaboration avec l’Institut Gustave Roussy (Michel Ducreux et David Malka, département de médecine) et l’Institut Curie (Xavier Sastre-Garau, chef du département Biologie des tumeurs, service de pathologie). Sur ce thème, BSI coordonne le projet européen COBRED (Colon and Breast Cancer Diagnostics, www.cobred.org), qui réunit, outre les deux centres de lutte contre le cancer, la société Ipsogen (Marseille, spécialisée dans la génomique), Biocrates Life Sciences (Innsbruck, Autriche, spécialisée en métabolomique), l’université de Debrecen (Hongrie) – où se trouve le deuxième laboratoire de BSI –, l’université d’Innsbruck et l’université de Tartu (Estonie). La Commission européenne finance ce consortium à hauteur de 2,9 millions d’euros sur trois ans (2007-2010).

 
Bâtiment où se trouvent les locaux de BioSystems International
dans la Génopole d’Evry
©BSI

Pour les cancers, mais aussi pour d’autres maladies chroniques telles que le diabète de type 2, les maladies cardiovasculaires, rhumatismales (polyarthrite rhumatoïde, arthrose etc.) ou neurologiques (Alzheimer, Parkinson, sclérose en Plaques, sclérose latérale amyotrophique…), la détection de biomarqueurs pourrait permettre, lors des essais cliniques d’un médicament, de prédire « en amont », le plus tôt possible, l’amélioration de l’état des patients bien avant que celle-ci n’intervienne effectivement, ce qui réduirait la durée des essais.
En effet, pour des pathologies qui évoluent sur le long cours, la mesure des progrès thérapeutiques exige des essais cliniques de très longue durée et dont très coûteux. Selon Laszlo Takacs, les prédictions pronostiques générées par la technologie de BSI pourraient faire gagner plusieurs années sur le temps de développement clinique d’un nouveau médicament, actuellement estimé entre six et huit ans. Des négociations sont en cours avec une société pharmaceutique afin de finaliser un partenariat susceptible de confirmer cette perspective, indique François Liebaert, vice-président chargé du développement commercial et des finances de BSI.
Trois ans après sa création, BioSystems International vient de nommer un nouveau CEO, Jean Pierre Tirouflet, et poursuit un parcours ambitieux, avec l’aide de fonds recueillis auprès de Société Générale Asset Management (SGAM, 3 M€), de subventions de la Commission européenne et du ministère hongrois de l’éducation en Europe, du  National Cancer Institute (NCI, NIH) aux Etats-Unis (1,5 M€) et de l’Agence française de l’innovation (Oséo Anvar). Elle dispose également de revenus réguliers grâce à deux contrats de recherche avec des industriels : Euroscreen (Bruxelles) sur une maladie inflammatoire et AstraZeneca sur l’arthrose. Comptant dix salariés à Evry, six en Hongrie, et bientôt une filiale aux Etats-Unis, un réseau de conseils scientifiques en Europe et aux Etats-Unis, la société d’Evry ne demande qu’à faire ses preuves dans un contexte de concurrence montante. Si l’un au moins de ses programmes de recherche se voyait couronné de succès, elle pourrait raisonnablement apparaître comme l’un des leaders du secteur des biomarqueurs et donner naissance à un leader européen du diagnostic par biomarqueurs.

Pour en savoir plus
www.biosys-intl.com
www.cobred.org



 Cerep, profil gagnant

« Cereper », c’est établir un « profil » d’action de molécules sur des cibles moléculaires. Ce néologisme utilisé par les spécialistes illustre la place enviable prise par la société Cerep sur le marché de l’évaluation des molécules thérapeutiques.

Le 18 décembre 2006, la société Cerep a annoncé qu’elle cessait ses activités non profitables, à savoir son activité de chimie (chimie médicinale et combinatoire, conception et synthèse de bibliothèques de molécules, modélisation moléculaire) et le développement clinique de deux candidats-médicaments en oncologie, assurés par sa filiale Anceris (Villebon). Cerep est pourtant l’une des premières entreprises européennes dédiées à la drug discovery. Mais il semble qu’il soit encore difficile pour une société française de biotechnologies de mener de front activités de services à même de générer des revenus et une recherche préclinique et clinique très coûteuse. Cerep souhaite donc désormais se concentrer sur ses seules activités de service rentables, le criblage à haut débit et le « profilage de molécules », avec sa base de données BioPrint®, ainsi que certains services cliniques, assurés par sa filiale Hesperion.



 Le profilage pharmaceutique

La société parisienne revient ainsi à ses fondamentaux ; après sa création en 1989 par Thierry Jean, alors chercheur au CNRS, elle s'est en effet construite sur un positionnement de services rendus à l'industrie biotechnologique, pharmaceutique, et chimique. Des fondamentaux qui lui ont permis de conquérir au fil du temps près de quatre cents clients : « quand un laboratoire pharmaceutique doit tester vingt mille molécules sur cinquante cibles, il comprend vite qu’il a tout intérêt à confier cela à un prestataire spécialisé, une fois assuré de la qualité des résultats et de leur confidentialité », explique Frédéric Revah, directeur scientifique de Cerep jusqu’en juin 2007.
Le « profilage de molécules » est sans doute ce qui a fait le plus la réputation de Cerep. « Certains spécialistes utilisent même le verbe ’’cereper’’ pour désigner cette activité », confie Frédéric Revah. Cette méthode de « pharmacologie in vitro », appelée aussi profilage à haut débit (HTP, High Throughput Profiling), consiste à évaluer rapidement la spécificité d’action d’une molécule sur des cibles et ses effets indésirables, liés à une activité sur des cibles imprévues. Pour cela, une batterie de plus de 600 tests in vitro a été mise au point. Ces tests analysent la liaison des composés aux récepteurs membranaires et nucléaires, aux canaux ioniques, le métabolisme cellulaire (enzymes, messagers intracellulaires...), etc. Une telle panoplie permet à la société de proposer à chaque client de choisir lui-même, en fonction de ses impératifs et des molécules à tester, les tests qui l’intéressent. Cerep offre également des profilages types réunissant des tests sélectionnés.
Une centaine de tests sont destinés à examiner très précocement le profil « ADMET » des composés, c’est-à-dire leurs propriétés d’absorption intestinale, de distribution dans l’organisme, de biodisponibilité liée au métabolisme, d’excrétion et de toxicité. Cette dernière est ainsi examinée sous différents angles : dommages cellulaires, cardiotoxicité, et interactions potentielles avec d’autres molécules pharmaceutiques.
En outre, des plates-formes plus spécifiques analysent sur cellules in vitro l’activation ou l’inhibition de récepteurs couplés aux protéines G (GPCR), ou des kinases (voies de signalisation), là encore dans l’idée de répondre à des demandes spécifiques et sachant qu’une grande partie de médicaments en développement interagissent avec ces protéines.

 
Structure d’un récepteur couplé aux protéines G (GPCR)
© Georgia Institute of Technology

 Une base pour prédictions in vivo

En complément de cette pharmacologie in vitro, Cerep a développé une base de données unique au monde, BioPrint®, qui peut être utilisée sous license par le client ou en prestations de services. BioPrint® rassemble toutes les données relatives à quelque 2 500 molécules pharmaceutiques commercialisées dans le monde ou ayant échoué en phases cliniques  ; soit environ sept millions de données issues de deux cents tests in vitro standardisés, des bases structurales et de la compilation de la littérature clinique. L’avantage ? BioPrint® rend possible l'analyse fine des liens entre comportement in vitro d'une molécule et comportement in vivo. La base peut donc, en fonction des similarités de profil des molécules candidates avec les données de la base, établir un véritable diagnostic prédictif qui définit quels seront leurs activités, leurs propriétés ADMET et donc leurs effets secondaires, non plus seulement in vitro, mais chez l’homme.
Plusieurs groupes pharmaceutiques ont ainsi confié leurs molécules à Cerep et certains ont pu éliminer en amont des molécules dont la toxicité était trop grande, affirme Frédéric Revah. Toutefois, poursuit-il, le profilage pharmacologique précoce ne met pas encore totalement à l’abri des mauvaises surprises. Mais l’on peut penser que l’intégration de nouvelles données de ce type dans BioPrint® devrait progressivement réduire un peu plus le risque.
BioPrint® peut aussi être utilisée afin de réorienter des médicaments vers de nouvelles indications (drug repositioning), un marché que l’industrie pharmaceutique regarde de très près afin de rentabiliser au mieux ses coûts de R&D. LS Pharma (Seattle), créée par deux anciens membres du management de Cerep, Mark Crawford et Vincent Charlon, développe cet objectif.
Ainsi, presque vingt ans après sa création, Cerep a acquis une notoriété internationale enviable et une taille de grande société avec près de 500 salariés. Fait significatif, ce succès a été entièrement bâti sur des technologies et des prestations de services en drug discovery et non sur le développement de médicaments, activité que l’entreprise a cessée en début d’année et qu’elle cherche à transférer à des partenaires. Ce positionnement original a permis à l’entreprise d'occuper une position concurrentielle forte et lui a évité de trop faire appel aux investisseurs (29 millions d'euros levés depuis sa création, Cerep étant entrée en bourse en 1998), tout en l’autorisant à réinvestir 30 % du chiffre d’affaires dans la R&D. Il suggère qu’une offre de services innovants peut être une solution viable pour des entreprises de biotechnologies dans un contexte où l’industrie pharmaceutique est à la recherche de savoir-faire spécialisés sur lesquels s’appuyer.

Pour en savoir plus
www.cerep.fr
www.hesperion.com

 OROXCELL :
l’optimisation par diagnostic et galénique moléculaires

Devinette : une société française de biotechnologies financée sur fonds propres et rentable dès la première année ; spécialisée dans l’optimisation de la biodisponibilité des nouvelles molécules à visée thérapeutique ; localisée à l’est de Paris au sein du parc Biocitech de Romainville (Seine Saint Denis)... Vous n’y êtes pas ? Il s’agit d’OROXCELL. Il est vrai qu’elle n’a pas encore le renom d’entreprises telles que Cerep. Mais trois ans tout juste après sa création, voilà une start-up qui affiche des résultats à faire pâlir bien des sociétés ayant pignon sur rue : 28 % de rentabilité dès la deuxième année sans appel aux investisseurs, une vingtaine de clients parmi les firmes pharmaceutiques, cosmétiques et les PME de biotechnologies, une plate-forme technologique intégrée très originale et un candidat-médicament en phase préclinique.


 Une offre intégrée

Son nom de baptême recèle trois sens : « Oro », car la société travaille sur l’évaluation et l’amélioration de l'absorption des composés administrés par voie orale ; « xcell » pour excellence ; et « cell » parce qu’elle développe et utilise des tests sur cellules. Ce sont trois chercheurs d’Aventis Pharma qui l’ont créée par « essaimage » en juillet 2004 : Jean Pachot, actuel président et directeur scientifique, Christophe Dini, directeur général et directeur des sciences de la matière, et Jacques Biton, directeur général et directeur des sciences de la vie. Le concept de l’entreprise, dès le départ, consistait à offrir des prestations de services dans des domaines complémentaires qui peuvent contribuer à l’optimisation des candidats médicaments : l’analyse des paramètres physicochimiques des molécules et des formulations médicamenteuses ; la bioanalyse des paramètres ADME (absorption, distribution, métabolisme, excrétion) qui évalue, grâce à des tests sur cellules in vitro et à l’aide d’études chez l’animal, l’absorption intestinale des molécules, leur biodistribution dans l’organisme, la production de métabolites et leur excrétion ; et la « galénique moléculaire », c’est-à-dire la détermination des formulations les mieux adaptées à l’absorption du produit. 
Cette offre intégrée fait l’originalité d’OROXCELL, explique Jean Pachot. « Les analyses physico-chimiques et ADME reposent sur l’observation de phénomènes à des fins de ’’diagnostic moléculaire’’, elles n’ont pas d’emprise sur le ’’cours de la rivière’’. La galénique moléculaire, elle, est une solution apportée aux défauts qui auraient pu être constatés lors des tests précédents et qui ne seraient pas forcément résolus par un retour à la chimie médicinale. La conjonction de ces trois facettes dans une entreprise de type CRO [organisation de recherche sous contrat] est à ma connaissance unique en France », ajoute Jean Pachot.
Pour chaque facette, la société a développé des solutions « maison ». Ainsi la culture cellulaire fait appel à une plate-forme robotisée, Pegase, conçue par des ingénieurs en adaptant et intégrant plusieurs appareils de biologie cellulaire. La mesure de la perméabilité moléculaire à travers les barrières biologiques telles que la peau et l’épithélium intestinal est réalisée à l’aide d’une plate-forme de biopharmacie regroupant différents modèles tissulaires. L’approche de galénique d’Oroxcell repose quant à elle sur une invention brevetée relative à la mise au point d’une « bibliothèque » de formulations mettant en œuvre des mélanges huileux à base d'excipients lipidiques et de tensioactifs. Ces mélanges inhibent les pompes à efflux de l’épithélium intestinal, responsables du rejet de certaines molécules actives administrées par voie orale, et facilitent ainsi leur passage dans le sang. L’entreprise peut aussi bien tester les formulations médicamenteuses soumises par le client que proposer des améliorations ou de nouvelles formulations – à des doses de l’ordre du gramme, ce qui limite les coûts –, l’objectif étant toujours d’augmenter le transfert intestinal des molécules et, partant,  leur biodisponibilité.



 Un candidat analgésique

Cette plate-forme globale a jusqu’à présent séduit des firmes telles que Beaufour Ipsen (Ipsen), Sanofi-Aventis, Servier, Pierre Fabre, Guerbet, Euroscreen (Bruxelles), L’Oréal, Galderma, une « bonne moitié des start-ups françaises », Mitsubishi et Japan Tobacco au Japon, indique Jean Pachot. Plus surprenant, Oroxcell, en consacrant 30 % de ses revenus à la R&D, a ajouté une nouvelle corde à son arc : la conception de médicaments. Un produit candidat destiné au traitement de la douleur chronique et neuropathique se trouve ainsi en phase préclinique. « Notre volonté est en effet de mettre à profit nos compétences internes en recherche pour découvrir de nouveaux médicaments que nous développerons ensuite en partenariat avec d’autres sociétés », précise Jean Pachot.
Avec bientôt trente-deux salariés, des récompenses publiques (lauréat du Concours national d’aide à la création d’entreprises de technologies innovantes, Master 2005 de la création d’entreprise), un prochain label « développement durable » qui garantit l’engagement de la société à respecter des normes environnementales et sociales, une rentabilité comptable et une crédibilité industrielle notable, OROXCELL présente les atours d’une belle réussite à l’échelle française, d’autant plus significative que les investisseurs n’y croyaient guère au départ, préférant les projets à « hauts risques et hauts revenus ». La concurrence montante de prestataires de services comparables dans les pays asiatiques ne semble pas inquiéter outre mesure son président, en raison de la supériorité européenne pour l’application des normes de qualité et le respect des délais, points capitaux pour ce domaine. La concurrence américaine, plus rude en raison de la faiblesse du dollar vis-à-vis de l’euro, fait envisager la création d’une filiale américaine, toutefois prématurée dans l’immédiat.
L’avenir d’OROXCELL, selon Jean Pachot ? « La poursuite de notre croissance, à notre rythme. Pour cette raison, nous ne sommes pas fermés à des ouvertures de capital. Mais à condition qu’elles préservent notre identité qui est désormais d’allier prestations de services applicables à la découverte de médicaments jusqu’aux études cliniques, et une R&D interne grâce à laquelle nous pourrons étoffer notre portefeuille de technologies et de médicaments. »

  
Pour en savoir plus
www.oroxcell.fr

 Ressources Internet