Chapitre 4 - Quelques exemples d’avancées scientifiques

Nous ne sommes pas égaux face aux bactéries, aux virus et aux parasites. Banalité que cela. Mais savez-vous que la génétique y est pour beaucoup ? Plusieurs équipes parisiennes s’emploient à explorer ce versant obscur des maladies infectieuses. Focus sur l’une d’entre elles, à la faculté de médecine Necker.

Depuis des siècles, les médecins observent que certaines personnes résistent mieux que d’autres aux maladies contagieuses. Longtemps, la chance ou une « meilleure constitution » ont pu servir d’explication. Avec l’avènement de la microbiologie, à la fin du XIXe siècle, le fait devenait scientifiquement explicable : une exposition variable à des souches microbiennes plus ou moins virulentes générait des réactions de défense différentes selon les individus. Louis Pasteur avait cependant souligné l’importance de facteurs non microbiens dans la susceptibilité à une infection. Une prescience confirmée aujourd’hui : les biologistes sont revenus à une explication « constitutionnelle », en l’occurrence génétique, des variations de résistance, ou inversement de susceptibilité, aux maladies infectieuses.
Ainsi, alors que la pandémie de sida due au VIH (virus de l’immunodéficience humaine) poursuivait son expansion, on a découvert en 1996 que certains individus d’origine européenne résistaient à une contamination par le VIH grâce à des mutations de la protéine CCR5, un co-récepteur du VIH présent sur certains lymphocytes. Plus récemment, c’est la protéine CCL3L1, qui empêche le virus de se fixer aux récepteurs des cellules immunitaires, qui a été associée à une résistance au VIH.

Parade pour pathogène mortel

En fait, dans les régions où les pathogènes persistent durant de longues périodes (zones d’endémie), il existe toujours une grande variabilité de la réaction à ces pathogènes, qui s’explique par des variations génétiques individuelles, explique Laurent Abel, codirecteur, avec Jean-Laurent Casanova, de l’unité Inserm 550 « Génétique humaine des maladies infectieuses » (faculté Necker, Université René-Descartes Paris 5). Une variation peut augmenter de fréquence dans la population lorsqu’elle engendre une résistance à un pathogène mortel, puisque les individus qui ne la possèdent disparaissent prématurément. Par exemple, l’équipe de Louis Miller (National Institutes of Health américains) a découvert dans les années 1970 que l’absence d’une protéine, DARC (Duffy antigen receptor for chemokines), à la surface des globules rouges, par suite de la mutation ponctuelle d’un gène, entraînait une résistance totale à l’un des agents du paludisme, Plasmodium vivax. En Afrique de l’Ouest, la mutation a donc eu tendance à se répandre, jusqu’à atteindre 80 % de la population - alors qu’elle est absente dans les populations européennes -, si bien que l’infection par le Plasmodium vivax y a quasiment disparu.
Cet exemple spectaculaire illustre les effets de la longue coévolution de l’espèce humaine et des microorganismes : sauf dans le cas des microorganismes « émergents » auxquels l’homme n’a pas eu le temps de s’adapter, tels que les souches de virus grippaux ou du VIH, il existe toujours, par le jeu des mutations qui surviennent continuellement dans le génome humain, une proportion d’individus résistants à un pathogène donné. En corollaire, précise Laurent Abel, la vulnérabilité d’un individu à un agent infectieux peut être comprise comme la traduction de l’absence d’une pièce de son arsenal immunitaire. Si l’on considère la mortalité actuelle due aux maladies infectieuses, qui se compte en millions chaque année, la proposition a de quoi surprendre ! Néanmoins, elle se confirme bel et bien au fur et à mesure des recherches.
Celles-ci suggèrent que la plupart des maladies infectieuses communes sont favorisées par de petites variations génétiques – les  polymorphismes – très communes mais dont l’effet propre est modeste et donc difficile à détecter. Pas facile ainsi de savoir, lors d’une épidémie de grippe, dans quelle mesure la variabilité génétique individuelle joue dans la résistance ou la susceptibilité à la contagion ou au développement de l’infection, en comparaison d’autres facteurs (virulence de la souche, degré d’exposition, état de fatigue, de stress, état nutritionnel, etc.). Il y a cependant des exceptions « mendéliennes », c’est-à-dire dues à une seule mutation génétique : ainsi, on a identifié à ce jour quatre individus atteints de tuberculose du fait de mutations dans le gène du récepteur de l’interleukine 12 (IL12) ou du récepteur de l’interféron gamma (IFNγ), deux médiateurs de l’immunité.


Mycobactéries et maladies rares

De même, des mycobactéries peu virulentes peuvent provoquer, chez des enfants prédisposés génétiquement, de graves maladies – distinctes de la tuberculose, causée par Mycobacterium tuberculosis ; le vaccin BCG (vaccin constitué par le bacille de Calmette-Guérin atténué) est ainsi la cause de BCGites dans une proportion de 0,6 cas par million d'enfants vaccinés. Or ces maladies rares se produisent en l’absence de déficit immunitaire connu, acquis ou héréditaire. A la fin des années 1990, l’équipe de Necker a montré que la prédisposition à ces infections est liée à des mutations de six gènes (IFNGR1, IFNGR2, STAT1, IL12B, IL12RB1, et un gène du chromosome X, NEMO, pour NF-kappaB essential modulator). L’altération de ces gènes perturbe la production de médiateurs de l’immunité : l’interleukine 12 (IL-12), l’interleukine 23 (IL-23) et l’interféron gamma (1). Considérées initialement comme rares, ces mutations sont la cause d’au moins treize maladies distinctes qui touchent plus de 220 patients dans une quarantaine de pays.

Un autre exemple fameux est celui de la lèpre, causée par une autre mycobactérie, le bacille de Hansen (Mycobacterium leprae). En 2004, la combinaison de stratégies d’épidémiologie génétique (voir l’encadré ci-dessus) a conduit Alexandre Alcaïs, Laurent Abel et leurs collaborateurs de Necker, associés à des chercheurs vietnamiens, canadiens et brésiliens, à caractériser deux gènes de susceptibilité à la lèpre. Une première étude menée au Vietnam et au Brésil avait identifié une région impliquée sur le chromosome 6. Puis les chercheurs ont établi que la présence de certaines variations génétiques dans des zones chromosomiques qui régulent les gènes PARK2 et PACRG était associée à un risque cinq fois plus élevé de développer la maladie. La fonction de ces gènes est actuellement explorée à l’aide de souris chez lesquelles ils sont

inactivés. PARK2 avait été précédemment identifié comme responsable de certaines formes à début précoce de la maladie de Parkinson. Il semble que l’enzyme correspondante, la parkine, soit une ubiquitine ligase, une enzyme qui participe à la « cascade d’ubiquitination », qui désigne les protéines qui seront dégradées par l’« usine de recyclage » de la cellule, le protéasome (2). Plus récemment, un second gène a été identifiée qui code la lymphotoxine-alpha (LTA), une molécule impliquée dans la préponse anti-mycobactérienne (3). Le variant génétique en cause diminue la production de LTA et est associée à un fort risque de présenter une lèpre à un âge précoce (avant vingt ans).

La susceptibilité variable aux maladies virales est un autre grand axe de recherche, partagés par plusieurs autres équipes parisiennes (voir l’encadré ci-dessous). Par exemple, les virus de l’herpès (HSV1 et HSV2), causes du « bouton de fièvre » et de l’herpès génital, peuvent déclencher de graves encéphalites chez des enfants par ailleurs non immuno-déprimés (deux cas annuels par million d’habitants). L’équipe de Necker a montré que l’altération d’une voie de l'immunité innée impliquée dans la production des interférons de type I (IFN /) est la cause de la prédisposition à l’encéphalite herpétique : la voie du Toll-like receptor 3 (TLR3) (4). Un premier pas… En la matière, les chercheurs ne sont qu’au début d’une exploration qui pourrait permettre, à terme, d’affiner la prévention et la prise en charge de nombreuses maladies infectieuses.

1. O. Filipe-Santos et al. (2006) J Exp Med. 203: 1745-1759.
www.jem.org/cgi/content/full/203/7/1745

2. E. Schurr et al. (2006) Semin Immunol. 18: 404-410.

3. A. Alcais et al. (2007) Nat Genet. 39:517-22.

4. A. Casrouge et al. (2006) Science 314: 308-312.

Pour en savoir plus

Site du laboratoire de génétique humaine des maladies infectieuses, faculté Necker (Inserm U550)
www.hgid.net

La recherche sur le paludisme est une vieille tradition à Paris. Plusieurs groupes de recherche la poursuivent avec les outils modernes de la biologie (génomique, protéomique, imagerie). Coup de projecteur sur l’un d’entre eux, à la Faculté de Médecine Pierre et Marie Curie.  

Chaque nuit, le même film gore se déroule des millions de fois sur la Terre : un anophèle femelle, moustique du genre Anopheles, transperce l’épiderme d’un être humain de ses stylets rigides et effilés, injecte dans les capillaires sanguins de la peau sa salive chargée d’anticoagulants, et aspire quelques microlitres de sang. Or, dans les pays tropicaux, les glandes salivaires des anophèles contiennent fréquemment des parasites unicellulaires, les Plasmodium, sous forme de cellules appelées sporozoïtes. Injectés avec la salive dans la circulation sanguine d’un homme, les sporozoïtes vont en quelques minutes infecter son foie. Première étape d’un cycle qui cause chaque année 500 millions d’épisodes cliniques et le décès de plus d’un million de personnes – principalement des enfants –, faute de soins appropriés !      

Estimation du nombre de cas de paludisme par pays en 2004
Source : OMS, World Malaria Report, 2005    
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Stopper le parasite dans le foie Parmi les quatre espèces de Plasmodium responsables du paludisme, P. falciparum et P. vivax sont les plus redoutées. La première, surtout, provoque les cas les plus sévères, potentiellement mortels, notamment en Afrique sub-saharienne. L’équipe du laboratoire d’Immuno-Biologie Cellulaire et Moléculaire des Infections Parasitaires, dirigée par Dominique Mazier au CHU Pitié-Salpêtrière, à Paris (Inserm U511/Université Pierre et Marie Curie-Paris 6), s’attaque résolument à ce fléau en essayant de le stopper dans les premières phases qui suivent la piqûre. Soit avant même qu’il n’atteigne les cellules du foie, ou en l’empêchant de se multiplier pour infecter les globules rouges (voir la figure du cycle). Deux stratégies complémentaires, fondées sur les avancées fondamentales concernant la biologie du parasite, sont suivies : la recherche de molécules capables de tuer les formes hépatiques du parasite (les schizontes), et des approches vaccinales. Le laboratoire s’intéresse également aux mécanismes en jeu dans le neuropaludisme, complication gravissime du paludisme à P. falciparum (voir l’encadré « Le neuropaludisme »).    

Cycle de vie de Plasmodium falciparum    
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Lors d’une piqûre, un anophèle femelle injecte des sporozoïtes dans la circulation sanguine d’un homme. Les sporozoïtes gagnent le foie en quelques minutes et infectent les hépatocytes, où ils se différencient en schizontes hépatiques. Après 1 semaine de divisions, les schizontes matures libèrent des milliers de mérozoïtes dans le sang. Les mérozoïtes infectent les globules rouges, où chacun se multiplie pour libérer au bout de 48 heures une trentaine de nouveaux mérozoïtes, qui à leur tour infectent des globules rouges. Cette infection est responsable des symptômes de la maladie. Certains mérozoïtes se différencient en formes sexuées, les gamétocytes. Ceux-ci seront ingérés par un moustique à l’occasion d’une piqûre. La reproduction sexuée qui s’en suit dans l’estomac du moustique aboutit en 10 à 14 jours à la formation de sporozoïtes, qui gagnent les glandes salivaires de l’insecte et peuvent être transmis à un être humain à l’occasion d’une piqûre.
© O. Silvie et al. (2003) MEDECINE/SCIENCES 19 : 169-71, Ed. EDK  

« Le blocage du cycle du parasite avant ou pendant l’infection hépatique permettrait de prévenir à la fois les symptômes dus à l’infection des érythrocytes (les globules rouges) et la transmission au moustique », explique Dominique Mazier. Il existe peu de médicaments actifs au stade hépatique – l’essentiel des molécules étant, comme l’artémisinine, actives au stade suivant, érythrocytaire. Mais l’un, la primaquine, peut causer une anémie hémolytique chez les personnes déficitaires en une enzyme, la G-6-PD, soit chez 30 % des Africains ; l’autre, l'association atovaquone/proguanil (Malarone®), est efficace et bien toléré, mais il est très coûteux et inaccessible dans les pays en développement. De plus, utilisée seule, l’atovaquone (ATQ) entraîne l’apparition de  résistances du parasite.     

Formes hépatiques de P. falciparum (flèche) dans des cultures d’hépatocytes traitées par la tazopsine (15 μM) pendant 5 jours (en bas), par comparaison avec des cultures contrôles (en haut). A droite, marquage par le DAPI (colorant spécifique de l’ADN) ; à gauche, marquage spécifique de P. falciparum par des anticorps anti-PfHSP70. N : noyau hépatocytaire. Barre : 5 μm. Source : M. Carraz et al. (2006) PLoS Med 3(12): e513, dx.doi.org/10.1371/journal.pmed.0030513    

Les promesses d’une plante malgache

La recherche de nouvelles molécules actives au stade hépatique est donc une nécessité. L’équipe de Paris 6 a suivi cette logique en collaboration avec le Muséum national d’histoire naturelle (MNHN) et l’Institut malgache de recherches appliquées (1), assistée pour les prélèvements de tissu hépatique humain par le service de chirurgie digestive dirigé par Laurent Hannoun à la Pitié-Salpêtrière. Ces chercheurs (Maëlle Carraz et collègues) ont récemment démontré qu’un composé de type morphinane extrait de l’écorce de l’espèce malgache Strychnopsis thouarsii, une plante médicinale traditionnelle, prévient totalement l’infection des globules rouges, aussi bien sur des cultures d’hépatocytes humains ou murins (photos ci-dessus) qu’in vivo, chez la souris. Cette molécule a été nommée tazopsine (en Malgache, Tazo signifie paludisme). Un dérivé peu toxique, la NCP-tazopsine, a été isolé (2). Grâce à un financement « Emergence » 2007-2008 de l’Agence nationale de la recherche (ANR), la tazopsine va maintenant être testée au Gabon chez le chimpanzé infecté par Plasmodium falciparum. Un autre essai, réalisé en Thaïlande chez le macaque rhésus infecté par Plasmodium cynomolgi, portera sur la prévention des rechutes de la maladie dues aux formes hépatiques dormantes (hypnozoïtes) de Plasmodium vivax. Outre son activité, cette molécule a un double intérêt, explique Dominique Mazier : comme elle n’est active que sur les formes hépatiques du parasite, la pression de sélection qu’elle exercerait sur le parasite, donc le risque d’apparition de résistances, seraient limités ; de plus, elle n’empêcherait pas la formation d’une immunité naturelle contre les sporozoïtes dans les zones d’endémie.
Parallèlement à ces essais, la recherche d’autres molécules d’intérêt se poursuit. Mais tester de nouveaux composés actifs sur Plasmodium falciparum n’est pas une tâche facile car le parasite est rétif à la culture in vitro. Ces tests exigent donc des outils très spécifiques. En collaboration avec le groupe de Laurent Hannoun et l’équipe d’Eric Rubinstein et Claude Boucheix à l’Institut André Lwoff de Villejuif (Inserm U602, Microenvironnement et physiopathologie de la différenciation), les chercheurs de l’unité 511 ont développé une méthode in vitro de criblage à haut débit de l'activité de composés chimiques sur les formes hépatiques du parasite (3). Elle repose sur le système Odyssey, un scanner détectant dans l’infrarouge. Ce système, couplé à un logiciel informatique, permet de dénombrer automatiquement les cellules infectées, sous forme de spots fluorescents, et donc d’évaluer l’activité anti-parasitaire d’un composé donné (voir ci-dessous).    

Vue d’un puits de culture montrant des spots fluorescents émettant dans l’infrarouge. Chacun correspond à une cellule hépatique infectée. Plus le nombre de spots est faible, plus le composé testé est actif contre ce stade parasitaire.
© Inserm U511 (Audrey Gego et al., 2006.)        

Plusieurs molécules prometteuses ont ainsi été identifiées en collaboration avec le groupe de Françoise Colobert à Strasbourg
(Substances Naturelles/Chimie Moléculaire, UMR 7509 CNRS, Université Louis Pasteur, Ecole Européenne de Chimie, Polymères, Matériaux).

Par ailleurs, l’équipe a développé un modèle informatique dit QSAR
(Quantitative Structure-Activity Relationship) capable de prédire l'activité
antiplasmodium de nouveaux composés, en fonction d'indices relatifs à leur 
structure chimique (4).
Ce modèle, appliqué à une banque de molécules d'activité inconnue, a conduit
à identifier plusieurs composés potentiellement actifs, ce qui a été confirmé in
vitro et chez la souris.        

             
Les chercheurs tentent également de caractériser les fonctions des molécules intervenant dans la pénétration du parasite dans les cellules du foie. Pour cela, ils essaient de produire des lignées stables d’hépatocytes humains sensibles à Plasmodium falciparum. Ces lignées permettraient de faire du criblage de molécules thérapeutiques et aussi, une fois adaptées génétiquement,  de tester le potentiel des vaccins candidats à induire l’activation des lymphocytes cytotoxiques. A cette fin, les chercheurs déterminent les gènes qui sont inhibés ou surexprimés dans les hépatocytes sensibles à Plasmodium falciparum par comparaison à des cellules vulnérables à d’autres espèces de plasmodium mais réfractaires à falciparum. Ils utilisent pour cela des puces à ADN et ont également adapté aux cultures d’hépatocytes une technique en vogue en biologie, l’interférence ARN, afin d’analyser le rôle des gènes identifiés lors de l’infection (J.F. Jean-François Franetich et al., manuscrit en préparation).  

Vaccination : un travail de long cours


La deuxième stratégie antipalustre, la vaccination, se heurte encore à de nombreux obstacles, qu’elle soit préventive ou thérapeutique (5). La plupart des tentatives ont jusqu’à présent visé à empêcher l’invasion des cellules du foie par les sporozoïtes ou à détruire les hépatocytes infectés. Le vaccin le plus avancé, le RTS,S/AS02, est composé de deux polypeptides recombinants (RTS et S) isolés d’une protéine de la surface des sporozoïtes, la PfCSP (P. falciparum Circumsporozoite Protein) et du virus de l’hépatite B. Lors d’un essai clinique (phase II) mené au Mozambique en 2003 et 2004, on a observé que le risque d’épisodes cliniques avait été réduit de 30 % et le nombre d’épisodes cliniques graves de 58 %. Ce n’est pas si mal… mais ce n’est sans doute pas suffisant. D’autres vaccins ciblent le stade « globule rouge », les mérozoïtes. C’est le cas des vaccins « MSP » qui visent à produire une réaction immunitaire contre les protéines de surface des mérozoïtes (MSP, dont on compte au moins cinq formes). L’équipe de Pierre Druilhe, à l’Institut Pasteur (unité Parasitologie biomédicale), associée au groupe de François Spertini (Centre Hospitalier Universitaire Vaudois, Lausanne), a récemment relancé cette piste. Après trois injections au temps 0, puis à 1 et 4 mois d’un vaccin à base d’un segment synthétique de la MSP3 à 36 volontaires sains, des anticorps anti-MSP3 ont été observés chez 60 % des sujets et ont démontré une capacité à empêcher la croissance du parasite in vitro (65). Dans ce contexte, l’équipe de Dominique Mazier tente une approche plus « amont » en collaboration avec Laurent Rénia (directeur du département d’immunologie de l’Institut Cochin, Inserm/CNRS/Université Paris-Descartes). Elle vise à identifier à l’aide de puces à ADN les différences moléculaires entre les sporozoïtes qui sortent des glandes salivaires du moustique et les sporozoïtes en contact avec des hépatocytes humains. Une fois identifiés sur ces derniers les « déterminants antigéniques » qui induisent des réactions immunitaires protectrices, on peut produire les molécules correspondantes, immuniser des animaux et tester si les anticorps résultants inhibent la pénétration des sporozoïtes dans les hépatocytes. Un projet européen, MALINV, coordonné par Laurent Rénia, appuie ces recherches.  


(1) MNHN, Paris : laboratoire de chimie et biochimie des substances naturelles (CNRS UMR 5154) ; laboratoire de parasitologie comparée et modèles expérimentaux (CNRS IFR 101) - Institut malgache de recherches appliquées, Antananarivo : laboratoire de pharmacognosie appliquée aux maladies infectieuses
(2) M. Carraz et al. (2006) PLoS Med 3(12): e513  http://dx.doi.org/10.1371/journal.pmed.0030513
(3) A. Gego et al. (2006) Antimicrob Agents Chemother. 50(4):1586-9 http://aac.asm.org/cgi/content/full/50/4/1586?view=long&pmid=16569892
(4) N. Mahmoudi et al. (2006)  J Antimicrob Chemother. 57(3):489-97. http://jac.oxfordjournals.org/cgi/content/full/57/3/489
(5) G. Snounou, L. Renia (2007) Trends Parasitol. 23(4):129-132.
(6) P. Druilhe et al. (2005) PLoS Med 2(11): e344 dx.doi.org/10.1371/journal.pmed.0020344  ;

Pour en savoir plus

Inserm U511
www.inserm-u511.jussieu.fr

Projet européen MALINV
(Differential Expression of Malaria Invasion-Associated Proteins in the sporozoite: Novel Vaccination Strategy) 
http://europa.eu.int/comm/research/health/poverty-diseases/projects/100_en.htm 

Malaria Vaccine Initiative
www.malariavaccine.org

Une première mondiale : le 1er mars dernier, la fondation Drugs for Neglected Diseases initiative (DNDi, Initiative médicaments en faveur des maladies négligées) et sanofi-aventis ont lancé un nouveau médicament antipaludique, l’ASAQ. Il est destiné à être diffusé d’ici la fin 2007 en Afrique sub-saharienne, puis au-delà, à un prix défiant toute concurrence : environ 1$ le traitement, la moitié pour un enfant de moins de cinq ans.

L’ASAQ n’a pas été breveté. Fabriqué au Maroc, il sera disponible à prix « sans profit ni perte » sur les marchés publics, c’est-à-dire pour les organisations publiques des pays endémiques, les institutions internationales, les ONG et dans les pharmacies ayant adhéré au programme d’accès aux antipaludiques de sanofi-aventis. Il sera vendu par ailleurs dans les officines sous le nom de Coarsucam à un prix adapté aux marchés locaux.

L’ASAQ est l’une des quatre associations à base d’artémisinine (substance extraite de l’armoise amère, Artemisia annua) qui ont été recommandées par l’Organisation mondiale de la santé pour réduire le développement de résistances aux médicaments de l’agent du paludisme, le plasmodium. Il s’agit d’une combinaison à doses fixes de deux produits déjà sur le marché, l’artésunate (AS, dérivé synthétique de l’artémisinine) et l’amodiaquine (AQ, dérivé de la famille de la quinine). Cette formulation est destinée à éviter que les patients ne prennent que l’un des deux composants actifs. Elle permet de limiter le traitement pour un adulte à une prise de deux comprimés pendant trois jours, au lieu de huit comprimés par jour actuellement. Pour les enfants, la posologie est aussi simplifiée : un comprimé pendant trois jours.

L’ASAQ est la résultante du projet  FACT (Fixed-Dose Artesunate Combination Therapy) né en 2002 sous l’égide de Médecins Sans Frontières. Ce projet, qui a rassemblé plusieurs partenaires universitaires et industriels, a été financé jusqu’en 2009 à hauteur de 6,4 M€ par des donateurs publics et privés. Un groupe d’experts, le FACT Implementation Advisory Group, est chargé de suivre la phase de mise à disposition de l’ASAQ.




Pour en savoir plus

www.actwithasaq.org/fr/asaq1.htm
www.dndi.org

Quelle est la forme biologique la plus abondante sur la Terre ? Des virus, les bactériophages, dont on a estimé la population à 1030 particules. Insoupçonnable, cette profusion joue probablement des rôles multiples dans la biosphère. En médecine, elle pourrait avoir des retombées inattendues.

Les derniers prédateurs de l’homme... Le baiser qui tue... Bon nombre de virus justifient leur mauvaise réputation tant ils sont redoutables pour l’espèce humaine, à l’exemple des virus de la grippe et de l’immunodéficience humaine (VIH). Cependant, la grande majorité des quelque deux mille virus connus ne s’attaquent pas à l’homme ni même aux autres mammifères, mais aux bactéries. Découvert en 1915 par le bactériologiste anglais Frederick William Twort (1877-1950) puis en 1917 par le biologiste canadien Félix D'Herelle (1873-1949), le parasitisme de ces bactériophages (ou simplement phages), dont les racines plongent aux premiers temps de la vie sur Terre, fait l’objet d’un regain d’intérêt parmi les biologistes après avoir été aux sources de la biologie moléculaire dans les années quarante. D’une part parce que l’on prend conscience que les phages, premier groupe de virus avec plus de cinq mille types, sont omniprésents sur la planète et qu’ils transfèrent en permanence, dans tous les milieux, des gènes et des facteurs de virulence entre les populations de bactéries ; d’autre part, parce que l’on redécouvre depuis les années 1990 que ces meilleurs ennemis des bactéries pourraient être exploités pour traiter des infections résistantes aux antibiotiques. Les bactériophages ont donc un air « Dr Jekyll et Mr Hyde » qui fascine, tout comme le héros de Robert Louis Stevenson.

Le bactériophage T4 sur le point d’infecter une bactérie cible.
© Purdue University and Seyet LLC

Cycle du phage lambda
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Certains bactériophages dits « virulents », comme le phage T4, ne se multiplient que par cycle lytique : la réplication virale aboutit à l’éclatement de la bactérie. L’ADN bactérien est dégradé et des segments peuvent être intégrés à des particules phagiques lorsque celles-ci sont libérées puis être transmis à d’autres bactéries lorsque d’une autre infection. O parle de transduction. D’autres bactériophages dits « tempérés », comme ici le phage lambda, peuvent suivre un cycle lytique (à droite) ou un cycle lysogénique caractérisé par l’intégration de l’ADN phagique dans le chromosome bactérien, sous forme d’un « prophage » (en rouge, à gauche). Ce prophage est copié avec l’ADN bactérien et transmis aux bactéries filles. Sous l’influence de facteurs environnementaux, le prophage peut se détacher du génome hôte, donner naissance à des phages actifs qui lysent la cellule hôte puis infecteront d’autres bactéries. A cette occasion, les prophages emportent parfois des gènes bactériens adjacents avec eux. Ce processus de « transduction localisée » est aussi à l’origine du transfert horizontal de gènes entre bactéries.

Des transferts horizontaux à la pelle

La face « Hyde » des bactériophages est devenue célèbre avec les ravages qu’ils causaient dans les industries ayant recours aux fermentations bactériennes, notamment fromagères. Des méthodes de détection peuvent désormais prévenir ces attaques, et les chercheurs tentent de fournir à l'industrie agroalimentaire des souches de bactéries lactiques plus résistantes et mieux adaptées. Puis on s’est aperçu que ces nuisances pouvaient concerner la santé humaine. Dernier élément en date de cette prise de conscience, l’équipe d’Elisabeth Carniel et Anne Derbise, de l'unité des Yersinia de l'Institut Pasteur, a découvert début 2007 que l’extrême virulence du bacille de la peste (Yersinia pestis ) était due à un phage. En comparant son génome avec celui de son ancêtre, Yersinia pseudotuberculosis, une bactérie très proche mais peu pathogène, les chercheurs avaient précédemment identifié des régions génomiques spécifiques du bacille de la peste. Ils ont ensuite découvert que l'une de ces régions codait un phage baptisé « Ypf » (Y. pestis filamentous phage) et que ce virus pouvait infecter d'autres bactéries (1). En l'absence du phage, le bacille de la peste perd une partie de sa pathogénicité, ce qui revient à dire que le transfert du phage Ypf dans des bacilles peut augmenter leur virulence potentielle.
De même, en 2005, en réalisant des comparaisons génomiques d'un grand nombre de souches du méningocoque (Neisseria meningitidis), l'équipe de Xavier Nassif (Inserm U570, faculté Necker, Université Paris-Descartes) et de Colin Tinsley (U570 et Inra Paris-Grignon) a mis en évidence l'existence d'un « prophage » dans les souches responsables des méningites que peut provoquer cette espèce en franchissant la barrière hémato-encéphalique (2). Un prophage, c'est-à-dire le matériel génétique d'un phage inséré dans l'ADN bactérien (voir le schéma ci-dessus). Ce prophage, qui pourrait coder une protéine favorisant les propriétés invasives de N. meningitidis, peut se détacher du chromosome bactérien, sortir de la bactérie en empruntant un canal formé par une protéine, la sécrétine, et se disperser dans la population de méningocoques.
Le rôle des phages dans le transfert horizontal d’ADN a été identifié pour plusieurs autres maladies infectieuses, notamment celles qui sont caractérisées par la production de toxines : le botulisme (dû à Clostridium botulinum), la diphtérie (Corynebacterium diphtheriae), les syndromes dus aux souches Escherichia coli O157 (shiga-toxine), le choléra (Vibrio cholerae). Il est toutefois probable que divers autres facteurs de pathogénicité sont ainsi transférés (3).

Un leurre commun aux phages et aux intégrons

Dans le cas du vibrion cholérique, c’est le bactériophage CTX qui le rend capable de produire la toxine à l’origine des diarrhées mortelles du choléra. En 2005, le groupe de Didier Mazel (Unité Plasticité du génome bactérien, CNRS URA 2171, Institut Pasteur) et celui de François-Xavier Barre (Centre de génétique moléculaire, CNRS, Gif-sur-Yvette) ont découvert comment le phage CTX « pirate » la machinerie cellulaire de la bactérie pour intégrer son génome dans le chromosome bactérien. Une région de l’ADN viral prend la forme du site d’action d’enzymes bactériennes, les intégrases, dont la fonction est d’échanger des fragments d’ADN distincts. Ainsi leurrées, ces enzymes intègrent le génome viral dans un des deux brins de l’ADN bactérien (4). Le groupe de Didier Mazel et de Deshmukh Gopaul (Institut Pasteur, CNRS URA 2185) a par ailleurs montré qu’un mécanisme structurel similaire explique probablement l’acquisition des résistances aux antibiotiques par certaines bactéries. En effet, certaines régions appartenant aux intégrons et superintégrons, séquences d’ADN qui disséminent les gènes de résistance aux antibiotiques entre différentes espèces bactériennes, adoptent une structure tridimensionnelle qui les font reconnaître par les intégrases (5, 6).
Des bactériophages ont été eux-mêmes impliqués dans l’apparition de souches résistantes aux bactéries. Par exemple, un nouveau type de phage a été trouvé associé à plusieurs centaines de souches de staphylocoque doré résistantes à la méticilline (SARM) dans des hôpitaux belges (7). Le staphylocoque doré (Staphylococcus aureus), des streptocoques tels que le bacille pyocyanique (Streptococcus pyogenes), des salmonelles (Salmonella typhimurium) sont connus pour abriter une multitude de phages codant des facteurs de virulence dont la diversité augmente au fur et à mesure des transferts d’ADN opérés par les phages entre les bactéries (8-11).
D’un point de vue médical, ces connaissances peuvent sembler sans surprise et un peu vaines. Toutefois, on peut penser que le décryptage des mécanismes de transfert horizontal et d’intégration des phages aux génomes bactériens, comme dans le cas du phage CTX, pourraient contribuer au développement de nouveaux outils thérapeutiques contre certaines bactéries pathogènes.
En attendant, les phages apportent déjà une contribution importante à la médecine.  C’est leur côté « Jekyll ». Des banques (« librairies ») de phages génétiquement recombinés permettent de sélectionner des molécules d’intérêt diagnostique ou pharmaceutique (phage display). Associés à des nanoparticules fluorescentes (quantum dots), ils pourraient servir à établir des diagnostics microbiologiques de terrain très rapides (voir la photo ci-dessous). Ils émergent dans le secteur agroalimentaire. Ainsi, en août 2006, l’agence américaine d’autorisation des médicaments (FDA) a autorisé pour la première fois l’utilisation de phages dans un produit destiné à la consommation humaine ; en l’occurrence un cocktail mis au point par la société Intralytix (Baltimore, Etats-Unis, http://www.intraltyix.com/) consistant en un aérosol à base de six phages purifiés applicable à la surface de viandes prêtes à être empaquetées, en prévention de leur contamination par des souches de la bactérie Listeria monocytogenes (12).  La société néerlandaise EBI Food Safety (http://www.ebifoodsafety.com/) a elle aussi annoncé la commercialisation aux Etats-Unis d’un produit comparable, Listex P100, pour détruire les Listeria susceptibles d’infecter la viande et le fromage.

 



Des scientifiques du National Cancer Institute (NCI) et du National Institute of Standards and Technology (NIST) ont mis au point un test diagnostique microbiologique rapide à base de phages qui ont été génétiquement modifiés pour se lier à des nanoparticules fluorescentes, les quantum dots. L’image montre des complexes phages-quantum dots (spots brillants) attachés à des cellules d’Escherichia coli (formes cylindriques)
© NCI/NIST – source : R. Edgar et al. (2006) PNAS 103 :4841-4845
http://www.pnas.org/cgi/reprint/103/13/4841.pdf

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Le renouveau de la phagothérapie

Mais l’une des perspectives les plus étonnantes consiste à utiliser les phages en complément des antibiotiques classiques, face aux bactéries multirésistantes. Cette « phagothérapie » en puissance a connu son heure de gloire dans les années 1920-1930 sous l’influence de Félix d’Herelle ; à l’époque, des préparations à base de phages ont été commercialisées par des firmes pharmaceutiques telles que Eli Lilly et, en France, par les laboratoires Robert et Carrière, raconte le Dr Alain Dublanchet, directeur du laboratoire de Microbiologie et hygiène au Centre hospitalier intercommunal de Villeneuve-Saint-Georges (Val-de-Marne). Puis avec l’avènement de la pénicilline et des sulfamides à partir des années 1940, le remède est tombé progressivement dans l’oubli d’autant qu’il essuyait des critiques visant le peu d’évaluations cliniques dont il avait fait l’objet. Toutefois, en Europe de l’Est, la pratique de la phagothérapie n’a jamais cessé. En Géorgie d’abord, où Félix d’Herelle avait créé en 1923 avec son élève George Eliava, l’Institut Eliava, à Tbilissi (13-15). Mais aussi en Pologne à l’Institut Ludwik Hirszfeld d’immunologie et de thérapie expérimentale de Wroclaw (http://www.aite.wroclaw.pl/index_en.html).
En occident, y compris aux Etats-Unis, des firmes ont fabriqué durant des décennies des suspensions phagiques à usage thérapeutique. En France, la phagothérapie s’est maintenue jusque dans les années 1970 sous forme de spécialités commercialisées par le Laboratoire du bactériophage fondé par Robert et Carrière pour le traitement des gastroentérites et des infections purulentes de la peau et à l’Institut Pasteur, sous l’impulsion de Pierre Nicolle et de Jean-François Vieu (16). Puis elle a décliné durant l’âge d’or de l’antibiothérapie et parce que personne n’avait repris le flambeau après le départ à la retraite du Dr Vieu. Alain Dublanchet indique pourtant que les suspensions de phages fabriquées dans les instituts Pasteur (Paris et Lyon) à l’époque lui ont permis de traiter une quinzaine de cas d’infections graves, non guéries par les antibiotiques, notamment des problèmes orthopédiques. Plus récemment, il a pu soigner une otite purulente avec un cocktail de phages provenant de Géorgie.

Remède miracle ?

Un film documentaire, La Guerre des phages, a popularisé les vertus anti-infectieuses des phages au travers d’un reportage à l’Institut Eliava (17). On y voit des patients lourdement infectés par des staphylocoques résistants aux antibiotiques, sans espoir de survie, repartir sur pied après quelques semaines de phagothérapie. L’institut commercialise des produits à base de phages, comme le PhageBioDerm, pour traiter des blessures infectées résistantes aux antibiotiques. Sa réputation est telle que des malades américains succombent à la promotion faite par le Phage Therapy Center de Tbilissi (http://www.phagetherapycenter.com/), une société créée en 2003 par des chercheurs locaux. Le prix de la guérison : entre 8 000 et 20 000 dollars !
A l’Ouest, en Amérique du Nord et dans plusieurs pays européens (Royaume-Uni, Allemagne, Belgique, France), la phagothérapie commence à susciter un regain d’intérêt avec la montée des multirésistances bactériennes aux antibiotiques, parallèle au désinvestissement de l’industrie pharmaceutique dans ce domaine jugé peu rentable. La « preuve de concept » a été apportée par plusieurs équipes chez l’animal depuis la fin des années 1990. Par exemple, l’équipe de Paul Gulig (Université de Floride, Gainesville) a montré que des phages réduisaient l'infection chez la souris par Vibrio vulnificus, un vibrion qui peut causer des septicémies à la suite de consommation de fruits de mer contaminés (18). Récemment, Laurent Debarbieux, un jeune chercheur du département de microbiologie de l’Institut Pasteur (Paris), a confirmé ce potentiel dans le cas d’une infection expérimentale chez la souris par Pseudomonas aeruginosa.
Les phages – du moins les phages lytiques, dont le génome ne s’intègre pas en général au chromosome de la bactérie hôte – ont plusieurs avantages, comparés aux antibiotiques. Tout d’abord, en infectant leurs cibles bactériennes, ils se répliquent et donnent naissance à des dizaines d’autres phages qui sont libérés lors de l’éclatement de la cellule hôte et qui infectent et détruisent à leur tour les bactéries voisines. Cet effet d’amplification va donc à l’inverse des effets d’un médicament dont la concentation diminue avec le temps. De plus, les phages sont spécifiques de chaque espèce bactérienne, ce qui limite leur action lytique aux seules espèces visées et évite de détruire la flore bactérienne utile.
Inversement, l’utilisation des bactériophages en thérapie humaine se heurte à plusieurs difficultés. Les phages, omniprésents dans la nature, exercent une pression sélective énorme sur les bactéries : pour survivre, celles-ci doivent en permanence « inventer » des moyens d’échappement et cette innovation permanente est sans doute pour beaucoup dans l’extraordinaire diversité microbienne de la Terre  (19). Ce phénomène risque donc de se reproduire avec la phagothérapie et induire des résistances. La solution, bien rodée en Géorgie, passe par l’utilisation de « cocktails » de phages différents, équivalents aux associations de médicaments employées classiquement en thérapeutique anti-infectieuse pour contrer les résistances bactériennes.

Des phages rendus plus performants

Autre faille cependant, la lyse bactérienne libère brutalement dans l’organisme des millions de phages, reconnus comme étrangers par l’organisme traité. La production d’anticorps anti-phages pourrait donc annihiler tout traitement ultérieur avec les mêmes phages. Par ailleurs, on connaît mal les effets toxiques de ces virus et leur durée de persistance dans l'organisme. Les phages lytiques, même si leur génome ne s’intègre pas au chromosome de la cellule hôte, peuvent aussi transférer de l’ADN bactérien (transduction) et véhiculer des facteurs de virulence.
Pour résoudre ces obstacles, des chercheurs pensent utiliser des phages lytiques qui tuent les bactéries qu’ils infectent sans les détruire car leur système lytique aurait été « déconnecté » par manipulation génétique. Les phages resteraient ainsi à l’intérieur de la bactérie morte et celle-ci serait ensuite digérée par les macrophages.
Une autre approche consisterait à utiliser les phages comme des vecteurs d’antibiotiques ou de gènes « tueurs » de bactéries ; le groupe de Caroline Westwater (Medical University of South Carolina, Charleston) en a posé les prémices en 2003 (20). Les phages pourraient aussi permettre d’identifier de nouvelles failles dans les défenses des bactéries, celles qu’utilisent les phages pour infecter leurs cibles. Les chercheurs travaillent en particulier sur des enzymes appelées lysines. A la fin du cycle viral, les lysines sont transportées dans la paroi bactérienne où elles clivent l’un des composants de la paroi, le peptidoglycane. On estime qu’il devrait être possible de créer des formes recombinantes de lysines capables de percer les parois bactériennes les plus résistantes. Le groupe de Vincent Fischetti (Rockefeller University, New York) a utilisé avec succès des lysines purifiées de phages spécifiques des streptocoques contre des infections expérimentales (21). La même équipe a décrit des lysines spécifiques d’infections systémiques (anthrax, pneumocoques, entérocoques) et apporté la preuve de concept de leur efficacité et de leur spécificité chez l’animal. Au Canada, la société Targanta Therapeutics (St-Laurent, Québec, http://www.targanta.com/) développe des polypeptides antibactériens issus de phages (22).

Où en est-on en France ?

Ces perspectives thérapeutiques, pourtant non dénuées de pièges, ont été à l’origine de plusieurs entreprises.
Outre Intralytix et Targanta, Novolytics (http://www.novolytics.co.uk/), essaimage de l’université de Warwick (Royaume-Uni), Advanced Biophage Technologies (ABT, Tbilissi, Georgie, http://ww.phagecure.com/), BioPhage Pharma (Montréal, http://www.biophagepharma.net/), Gangagen (Bangalore, Inde, et Palo Alto, http://www.gangagen.com/), Phage Biotech (Rehovot, Israël, http://www.phage-biotech.com/), ou encore Phage International (Los Altos, Californie, http://www.phageinternational.com/) dont le Phage Therapy Center Ltd de Tbilissi est désormais une filiale.


En France, la recherche n’en est pas à ce stade de développement. Les groupes qui se consacrent à la biologie des phages se comptent sur les doigts d’une main (voir l’encadré sur l’Ile-de-France). « Cependant, le thème a bénéficié d’un regain d’intérêt depuis une dizaine d’années, lorsque les biologistes ont réalisé que les bactériophages constituaient une réserve considérable de gènes inexploités, de nouvelles structures protéiques, et qu’ils étaient des objets de recherche passionnants et essentiels pour l’étude générale des virus, remarque Pascale Boulanger, chercheur au CNRS, qui travaille sur le phage T5 à l’Institut de Biochimie et Biophysique Moléculaire et Cellulaire de l’Université Paris-Sud. Reste que la phagothérapie a encore peu d’adeptes, car sa mise en œuvre est complexe et très différente du développement des molécules. Un phage n’est pas un médicament mais une entité biologique qui agit sur l’infection en se développant dans l’agent pathogène. La phagothérapie est une médecine sur mesure pour laquelle il faut trouver le bon virus pour chaque infection, ce qui demande de maintenir des banques de phages stables alors même que ces organismes mutent rapidement. »

Pour autant, Alain Dublanchet croit à l’avenir de cette thérapie. « Elle ne doit pas être une médecine alternative de l’antibiothérapie au sens où elle ne doit pas venir en ’’roue de secours’’ d’un échec thérapeutique, lorsque le patient est déjà trop affaibli. Elle peut être de première intention pour des indications spécifiques, en complément des antibiotiques, notamment pour traiter des infections chroniques ou nosocomiales localisées, telles les infections ostéo-articulaires. » Le Dr Dublanchet compte donc bien contribuer à relancer le savoir-faire « phagothérapeutique » en France, notamment en isolant de l’environnement des phages actifs sur des bactéries isolées dans des prélèvements hospitaliers. Laurent Debarbieux témoigne pour sa part des demandes régulières de phages qu’il reçoit de la part de cliniciens impuissants devant des décès consécutifs à des infections multirésistantes que l’on aurait pu soigner.
Reste à apporter les arguments scientifiques qui convaincront les sceptiques. Sur ce terrain, Laurent Debarbieux demeure prudent. Si la phagothérapie semble marcher chez l’animal et chez l’homme, il faut encore déterminer quels sont ses mécanismes d’action in vivo et répondre à de nombreuses questions restées en jachère jusqu’à présent : quelle est la durée d’action des phages, la proportion des cellules cibles éliminées, où et comment les phages se disséminent-ils, quelle est la reproductibilité d’un traitement, peut-il y avoir des effets toxiques, etc. Des questions en chaîne que le jeune pasteurien semble cependant être le seul à aborder en France, les moyens venant, comme souvent, après les preuves. La phagothérapie à la française devra donc attendre encore un peu son éventuel renouveau.
 

Les groupes franciliens travaillant sur les bactériophages

* Equipe « Transports Membranaires de Macromolécules », resp. : Lucienne Letellier, Institut de biochimie et biophysique moléculaire et cellulaire (IBBMC), CNRS - Université Paris-Sud, Orsay.
http://www.ibbmc.u-psud.fr/tmm/index.php

* Equipe « Etude métagénomique des bactériophages environnementaux », resp. : Michael Dubow, Institut de génétique et de microbiologie (IGM), CNRS UMR 8621, Université Paris-Sud, Orsay
http://www.igmors.u-psud.fr/DUBOW/DUBOW.htm

* Unité « Biologie moléculaire du gène chez les extrêmophiles » (BMGE), resp. : Patrick Forterre, Institut Pasteur, Paris. Sur la phagothérapie : Laurent Debarbieux.
http://www.pasteur.fr/recherche/unites/bmge-archaea/index.htm

* Equipe « Régulation génétique chez Salmonella et ses phages », resp. : Nara Figueroa-Bossi & Lionello Bossi, Centre de génétique moléculaire (CGM), CNRS, Gif-sur-Yvette
http://www.cgm.cnrs-gif.fr/salmonella/bossi_fr.html

* Equipe « Phages », resp. : Paulo Tavares, Laboratoire Virologie moléculaire et structurale, unité mixte CNRS (UMR 2472) - INRA (UMR 1157), Gif-sur-Yvette
http://www.gv.cnrs-gif.fr/

* Equipe « Métabolisme des ARN messagers chez les procaryotes », resp. : Marc Uzan, Institut Jacques Monod, CNRS, Université Paris Diderot, Université Pierre et Marie Curie, Paris
http://ijm2.ijm.jussieu.fr/ijm/recherche/equipes/metabolisme-arn-messagers-chez-les-procaryotes

* Equipe « Interactions phages/bactéries chez les bactéries lactiques », resp. : Marie-Christine Chopin, UR895 Génétique microbienne, INRA Domaine de Vilvert, Jouy-en-Josas
http://www.inra.fr/compact/nav/externe/fr/activites/ecrans/309

* Dr Alain Dublanchet, responsable du laboratoire de Microbiologie et hygiène, Centre hospitalier intercommunal de Villeneuve-Saint-Georges
http://www.chiv.fr/

1. A. Derbise et al. (2007) Mol Microbiol. 63(4):1145-57.
2. E. Bille et al. (2005) J Exp Med. 201(12):1905-13.
http://www.jem.org/cgi/content/full/201/12/1905
3. C.R. Tinsley et al. (2006) Microbes Infect. 8(5):1365-71.
4. M.E. Val et al. (2005) Mol Cell. 2005 19(4):559-66.
5. M. Bouvier et al. (2005) EMBO J. 24(24): 4356-67.
6. D. MacDonald et al. (2006) Nature 440(7088): 1157-62.
7. C. Wildemauwe et al. (2006) Clin Microbiol Infect. 12(10): 1036-8.
8. N. Figueroa-Bossi et al. (2001) Mol Microbiol. 39(2): 260-71. 
9. R.P. Novick et al. (2007) Chem Immunol Allergy. 93: 42-57. 
10. T. Bae et al. (2006) Mol Microbiol. 62(4): 1035-47. 
11. I. Sitkiewicz et al. (2006) Proc Natl Acad Sci U S A. 103(43): 16009-14.
12. http://www.cfsan.fda.gov/~dms/opabacqa.html ; http://www.intralytix.com/
13. T. Parfitt (2005) Lancet 365 : 2166-67.
14.  R. Stone (2002) Stalin’s Forgotten Cure, Science 298, 25 octobre, http://www.phageinternational.com/phagetherapy/stalin.htm
15.  http://www.evergreen.edu/phage/eliavalabs.htm
16. J.F. Vieu et al. (1979) Bull Acad Natl Med. 163(1):61-6.
17. http://www.filmsatrois.com/mag/fr/product-152668.htm
18. K.E. Cerveny et al. (2002) Infection and Immunity 70: 6251-6262.
http://iai.asm.org/cgi/content/full/70/11/6251?view=long&pmid=12379704
19.  A. Comeau, H.M. Krisch (2005) Curr Opin Microbiol. 8(4):488-94.
20. C. Westwater et al. (2003) Antimicrob Agents Chemother. 47(4):1301-7. http://aac.asm.org/cgi/content/full/47/4/1301?view=long&pmid=12654662
21. V.A. Fischetti et al. (2006) Nat Biotechnol. 24:1508-1511.
22. A. Belley et al. (2006) Molecular Microbiology 62 (4), 1132–1143.

 


Pour en savoir plus

N.H. Mann (2005) The Third Age of Phage, PLoS Biol 3(5): e182
http://biology.plosjournals.org/perlserv/?request=get-document&doi=10.1371/journal.pbio.0030182  
VIRUSES vs. SUPERBUGS
http://www.bacteriophagetherapy.info
Phage Biology, Elisabeth Kutter, Evergreen State College
http://www.evergreen.edu/phage/phagetherapy/phagetherapy.htm 
L. Debarbieux (2007) Les phages à l’assaut des bactéries, Pour la science, dossier 55 « Les virus, acteurs de l’évolution », avril-juin 2007, pp. 50-55.
http://www.pourlascience.com/