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Genewave, ou comment rendre les puces plus sensibles
Les biopuces permettent la détection en parallèle de multiples événements de reconnaissance moléculaire menant à l’identification de gènes, de virus, etc. Pour quantifier la liaison spécifique entre les molécules de l’échantillon étudié et des molécules sondes accrochées sur la couche chimique de surface de la puce, la plupart utilisent une détection optique : un rayonnement lumineux de longueur d’onde donnée excite des marqueurs fluorescents (fluorophores) liés aux molécules ; ceux-ci émettent alors une lumière fluorescente d’une autre longueur d'onde que l’on peut détecter et mesurer. En théorie, plus le rayonnement initial est intense et plus le nombre de liaisons molécules-sondes est grand, plus le signal final émis sera facile à capter et à interpréter.
En réalité, on est limité dans les deux approches : d’une part une excitation lumineuse trop puissante peut dégrader les molécules et engendrer un « bruit de fond » en excitant d’autres composés ; d’autre part, la densité de surface des molécules est elle-même limitée par l’espace disponible pour leur accrochage ainsi que par des phénomènes de dégradation du signal due aux interactions entre molécules trop proches. De plus, un défaut intrinsèque des lames standard est que l’excitation des fluorophores est inhibée par des interférences à l’interface air-puce, tandis qu’une grande partie du rayonnement émis par les marqueurs se disperse dans la puce elle-même et n’est donc pas collecté.
 Une solution : l’amplification de fluorescence
A la fin des années 1990, Claude Weisbuch et Henri Benisty, chercheurs du laboratoire Physique de la matière condensée à l’Ecole Polytechnique (Palaiseau), ont imaginé un moyen de compenser cette inefficacité intrinsèque des biopuces à fluorescence : utiliser un miroir qui limiterait les déperditions et concentrerait le faisceau fluorescent. Leur invention, brevetée sous diverses formes, consiste à déposer à la surface de la puce (qu’elle soit en verre, en silice ou en un autre matériau) une couche réfléchissante formée d’un miroir multicouche non absorbant recouvert d’un matériau à indice de réfraction élevé (comme l’oxyde de titane).
La société Genewave que les deux chercheurs ont fondée en décembre 2001 avec François Vallet, physicien de formation et désormais directeur général adjoint, exploite ce principe d’amplification optique du signal fluorescent des biopuces. En cinq ans, Genewave a développé une gamme de puces à amplification de fluorescence, AmpliSlide™, dont la sensibilité est quatre fois supérieure à celle des puces classiques. Un avantage essentiel : des molécules peu nombreuses, car correspondant à des gènes faiblement exprimés dans l’échantillon peuvent ainsi être détectées, et la quantité nécessaire de matériel biologique est réduite.
Genewave dispose depuis juin 2005 d’une plate-forme de préparation de la surface chimique des puces (silanisation), mutualisée dans le cadre du Groupe innovation biopuces d'Evry (GIB) (voir l’article Serial Genetics), et à partir de laquelle elle propose des services de fonctionnalisation « à façon » parallèlement au traitement de ses propres puces. Depuis septembre 2006, les premières puces AmpliSlide™ sont commercialisées « nues », c’est-à-dire simplement revêtues d’une couche d’aminosilane ou d’epoxysilane permettant l’accrochage des molécules sondes qui sont « spottées » à leur guise par les utilisateurs.
Pour l’heure, les clients sont essentiellement des laboratoires de recherche académique et industriels, mais Genewave escompte toucher rapidement le marché du diagnostic, le secteur militaire et l’industrie agroalimentaire. La plate-forme de préparation des puces AmpliSlide™ permet en effet de proposer d’autres « chimies de surface » adaptées à différentes utilisations. De plus, la société compte encore améliorer la sensibilité de ses puces en perfectionnant la couche optique amplificatrice (systèmes SmartSlide™, Rainbow™ et « AmpliSlide™ Plus » à l’étude).
Mesurer le signal
Genewave table sur une deuxième innovation pour assurer le succès des puces à amplification de fluorescence : une gamme de lecteurs de signal optique dont le premier représentant est l’AmpliReader™, un lecteur « bas coût », comparable en efficacité aux lecteurs du commerce. « Le gain de sensibilité obtenu grâce à nos lames amplificatrices a été mis à profit pour simplifier l’architecture globale du lecteur et donc limiter son coût de production », explique François Vallet. Ce lecteur est associé à un logiciel d’analyse des images mis au point avec la coopération du Centre de morphologie mathématique de l’Ecole de Mines. Cette architecture simple donne naissance à une famille complète de lecteurs à bas coût pour le diagnostic sur biopuce.
Le système HybLiveTM - Une lame AmpliSlide™ préalablement « spottée » avec des oligonucléotides a été hybridée et imagée dans la cartouche de la machine HybLive, avec un mélange équimolaire de cibles à détecter marquées par la cyanine fluorescente Cy5
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| FIG 1. Préhybridation, avant l’ajout des cibles : on voit les contrôles positifs (oligonucléotides marqués à la Cy5)
FIG 2. Hybridation, une minute après l’ajout des cibles : on voit déjà un signal d’hybridation sur un certain nombre d’oligonucléotides de la puce. On peut suivre ainsi en temps réel toute la phase d’hybridation (et éventuellement de déshybridation). La même puce est utilisable plusieurs dizaines de fois, avec autant d’échantillons différents.
FIG 3 (en bas à droite). En fin de procédure, le lavage permet d’éliminer la totalité du « bruit de fond ». | 
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Afin d’aller plus loin, en collaboration avec la Délégation générale à l’armement (DGA), Genewave a développé un système intégrant l’hybridation moléculaire sur puce et la lecture du signal : le système HybLiveTM, qui devrait être mis sur le marché en janvier 2008. « HybLive est actuellement le seul système capable de mesurer en temps réel des hybridations et des déshybridations multiples en parallèle, avec le contrôle des paramètres tels que la température et l’intensité du mélangeur, ce qui peut être très important pour un laboratoire de recherche ainsi que pour la mise au point de kits de diagnostic et de détection d’agents biologiques », se félicite François Vallet. Un des objectifs de Genewave est aussi de créer un système global miniaturisé et portable, qui permettra de réaliser des biocapteurs de terrain. A plus court terme, la société va exploiter le système HybLive en proposant, à partir de septembre 2007, des services d’analyse en temps réel des hybridations réalisées sur puces, ce qui permettra aux sociétés développant des diagnostics ou des médicaments de disposer d’un outil performant, sans avoir à en faire l’acquisition.
Miniaturiser l’analyse
Le prolongement de l’approche d’amplification et de miniaturisation amorcée par Genewave est la mise au point de « laboratoires-sur-puce » (LOC, lab-on-chip), des systèmes miniaturisés d’analyse biochimique qui gagneraient en compacité et même en sensibilité par rapport aux biopuces actuelles. C’est le projet P2-LOC. Il repose sur l’utilisation, comme substrat de la biopuce, de capteurs de caméras standards en technologie CMOS (Complementary Metal Oxide Semi-conductors, semiconducteurs complémentaire d'oxyde métallique). La sensibilité déjà obtenue est celle des meilleurs lecteurs actuels de biopuces, dans un volume équivalent à celui d’un lecteur webcam, selon Genewave. La mise au point de ces laboratoires-sur-puce demande toutefois une pièce de puzzle supplémentaire : la microfluidique, la technologie qui permet de transporter des fluides et des molécules dans des microcanaux. Genewave collabore sur ce plan avec plusieurs laboratoires spécialisés en France et en Europe. Elle espère mettre sur le marché ses premiers modèles en 2009. Sur le thème des labs-on-chip, la société participe en outre au projet européen Indigo, qui vise à développer des biocapteurs pour le diagnostic et les applications médicales (1), et au projet franco-allemand ARTAMIS de l’initiative EuroTrans-Bio, soutenu par Oséo-Anvar et qui rassemble en Ile-de-France la « plate-forme puces à ADN Gif-Orsay » (GODMAP, CNRS, Gif-sur-Yvette) et l’Ecole supérieure de physique et chimie industrielles (ESPCI). Avec quarante-cinq salariés (dont dix en apprentissage), le soutien d’un business angel, les financements par des programmes européens, par l’Agence nationale de la recherche (ANR) et Medicen Paris Région (projet BIOTYPE, biotypage multidimensionnel pour les thérapies moléculaires et cellulaires), le statut de « jeune entreprise innovante », les premières ventes de ses produits, et les perspectives commerciales et de R&D en cours... Genewave peut voir l’avenir en rose. Cerise sur le gâteau, elle dispose de locaux dans X-Tec, l’incubateur d’entreprises issues de l'Ecole Polytechnique et, ainsi, d’un environnement académique et industriel particulièrement motivant et attractif.
(1) Indigo (Integrated Highly Sensitive Fluorescence-based Biosensor for Diagnostic applications)
http://cbio.ensmp.fr/indigo
Pour en savoir plus
www.genewave.com
 Ressources Internet
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